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目的：Nogo-66抑制轴突生长的机制至今仍不完全清楚,关于MARK2(微管亲和力调节激酶2)在神经轴突生长中的作用研究也较少报道,MARK2是否参与Nogo-66抑制轴突生长尚未有研究报道。本实验旨在研究MARK2在Nogo-66抑制神经元轴突生长中的作用以及MARK2对轴突生长的作用机制,并且在脊髓损伤动物模型体内探讨MARK2基因对大鼠轴突再生的影响,为治疗脊髓损伤阻断髓鞘抑制提供一种最佳途径。方法：1.从Genbank中筛选MARK2基因,构建干扰MARK2表达的shRNA质粒和过表达MARK2的质粒。进行腺相关病毒包装,构建过表达MARK2及干扰MARK2表达的腺病毒重组体,并进行基因测序验证。2.传代培养N2a细胞,在5组细胞培养基中加入Nogo-66,保持15min、30min、6h、24h、48h的培养时间后,提取蛋白,利用western-blot法检测MARK2及p-Ser212(MARK2在Ser212位点磷酸化)蛋白表达量的变化。3.N2a细胞分别感染两种不同的腺相关病毒MARK2-AAV, shRNA MARK2-AAV后,应用western-blot和免疫荧光法对MARK2-AAV、shRNA MARK2-AAV的表达效果进行鉴定。4.N2a细胞感染MARK2-AAV、shRNA MARK2-AAV后,应用western-blot检测MARK2对于微管相关蛋白tau、p-S262 tau和MAP1-b表达量的影响。5.体外原代培养大鼠皮层神经元细胞,根据转染病毒的不同(EGFP-AAV或MARK2-AAV)及培养基有无Nogo-66 (DMSO),将神经元分为4组：HK+DMSO,OE+DMSO,HK+Nogo-66,OE+Nogo-66。应用免疫荧光显微镜拍照、测量每组神经元轴突长度,进行统计学分析。6.通过感染MARK2-AAV,在N2a细胞中过表达MARK2,应用western-blot和免疫荧光法检测N2a细胞内酪氨酸化和乙酰化艏蛋白的表达量变化。7.采用24只成年雌性SD大鼠脊髓全横断法建立大鼠脊髓损伤模型；根据脊髓损伤后处死时间的不同,分为6组:Control、SCI 1d、SCI 3d、SCI 7d、SCI 14d、SCI 21d(每组4只),取出损伤区脊髓(正常对照组T8段脊髓),应用western-blot检测MARK2及p-Ser212表达量变化情况。8.取16只成年雌性SD大鼠,4只为正常对照,12只建立脊髓损伤模型；建模7天后根据感觉运动区皮层注射介质(Saline、EGFP-AAV、MARK2-AAV)的不同,随机分为3组：Saline、EGFP-AAV、MARK2-AAV(各4只);建模14天后。在16只大鼠皮层相同位置注射BDA(神经示踪剂)。建模21天后处死所有大鼠灌注甲醛。正常组取脑及脊髓,免疫荧光显微镜检测BDA标记的轴突在脑及脊髓中的走行；建模组取损伤区脊髓,应用免疫荧光显微镜检测BDA,了解轴突再生情况。9.实验结果进行统计学分析并以means±SEMs表示,两组间的比铰采用配对t检验,两组以上使用单因素方差分析(one way ANOVA或two way ANOVA);由于检测目的及检测对象的不同,采用不同的方差后分析(Dunn’s posttests, Turkey posttests, Bonferroni posttest); P<0.05被认为具有统计学意义。结果：1.干扰MARK2和过表达MARK2的腺病毒重组体经酶切鉴定、测序,证明设计序列与设计的目的基因相符,构建腺病毒重组体成功。2.在加入Nogo-66不同时间后,总MARK2含量及MARK2在Ser212位点磷酸化程度发生了显著下降, 方差后分析结果显示在24h和48h两个时间点MARK2及p-Ser212均显著降低(与对照组比较,P<0.005)。3.免疫荧光和western-blot检测结果显示,MARK2-AAV能够显著提高MARK2表达量(与对照组相比,P<0.05),shRNA MARK2-AAV能够显著降低MARK2蛋白表达量(与对照组相比,P<0.05)。4.通过过表达MARK2或干扰MARK2表达,westem-blot结果显示MARK2显著影响tau、 p-S262 tau和MAP1-b的表达,呈明显正相关关系(P<0.05)。5.体外原代培养皮层神经元细胞在对照组中(HK+DMSO组)轴突长度为68.4±12.3μm,加入Nogo-66 (HK+Nogo-66组)后,轴突长度显著下降,为28A±6.3μm(与对照组HK+DMSO组比较,P<0.05)：过表达MARK2 (OE+DMSO组)后轴突长度显著增长,为117.4±22.6μm(与HK+DMSO组比较,P<0.05)；而经过MARK2-AAV预处理的神经元加入Nogo-66后(OE+Nogo-66组),能够明显减弱Nogo-66对轴突的抑制作用,轴突长度为66.8±9.4μm(与HK+Nogo-66组比较,P<0.05)。6.过表达MARK2后检测酪氨酸化α-微管蛋白和乙酰化α-微管蛋白,结果显示MARK2-AAV显著提高酪氨酸化的α-微管蛋白水平(P<0.05),乙酰化α-微管蛋白无明显变化。7.在脊髓损伤后的不同时间取损伤区脊髓后,MARK2及p-Ser212蛋白表达水平在脊髓损伤区显著降低(与正常对照组比较,P<0.05),证明脊髓损伤影响MARK2的表达及其磷酸化程度。8.脑和脊髓矢状位切片结果显示,BDA被神经元吸收后在脑及脊髓中沿神经束下行传导;BDA示踪结果显示,MARK2-AAV组轴突最长可以达到600μm,而Saline, EGFP-AAV组只有450μm, MARK2-AAV组与其它两组比饺有显著性差异P’<0.05);在轴突增生的不同长度值中,在200μm,300μm,400μm点,BDA标记的轴突比例均要明显高于Saline、EGFP-AAV组(P<0.01)。结论：本研究结果表明,Nogo-66显著降低总MARK2蛋白表达及Ser212位点磷酸化程度,MARK2通过调控tau及MAP1-b参与Nogo-66的抑制信号通路：MARK2-AAV通过提高酷氨酸化α-微管蛋白水平促进轴突的生长;MARK2-AAV能够显著减弱Nogo-66对轴突生长的抑制作用。在脊髓损伤后,总MARK2及其在Ser12位点磷酸化程度均显著下降；在皮层的感觉运动区立体定向注射MARK2-AAV能够显著促进轴突生长。表明神经元内MARK2/MAPs/a-tubulin信号通路在Nogo-66-NgR调控轴中起着十分关键的作用,MARK2为神经系统损伤后的再生修复带来了希望。