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目的:利用人脐带血CD34+细胞和人类多能干细胞(hESCs)与小鼠主动脉-性腺-中肾(mAGM)区基质细胞共培养以诱导分化产生造血细胞,建立红系细胞体外三维培养方法。比较传统悬浮培养与三维培养对红系细胞成熟度的影响。方法:一、材料选择:将hESCs与mAGM-S3(鼠AGM区来源的基质细胞系)基质细胞共培养12天后的细胞或人脐带血CD34+细胞种植进BeaverNano水凝胶、海藻酸钠水凝胶、胶原蛋白水凝胶、透明质酸水凝胶等材料内,与悬浮培养进行比较。通过流式细胞仪对细胞表面的抗原检测,比较不同材料与悬浮培养是否有利于红系细胞扩增,从而选择最优材料进行三维培养。二、细胞培养:1.脐带血:将人脐带血CD34+细胞进行悬浮培养及用透明质酸水凝胶进行三维培养,培养10天后,利用流式细胞仪和免疫荧光染色,对人脐带血CD34+细胞来源的红系细胞,比较悬浮培养和三维培养对红系细胞的功能影响。2.hESCs:将人类多能干细胞(hESCs)与小鼠主动脉-性腺-中肾(mAGM)区基质细胞共培养12天的细胞,进行悬浮培养及透明质酸水凝胶培养10天后,利用流式细胞仪,对hESCs来源的红系细胞,比较悬浮培养和三维培养对红系细胞的功能影响。结果:一、材料选择:人脐带血来源的CD34+细胞在BeaverNano水凝胶内培养后GPA+细胞为86.6%GPA+CD71+细胞为81.1%;而悬浮培养GPA+细胞达到54.5%,GPA+CD71+细胞达到49.1%。但是,嗜酸性粒细胞种植进BeaverNano水凝胶后也可表达76.3%的GPA以及 38.9%的 CD71。hESCs来源的造血干/祖细胞悬浮培养十天后的GPA+细胞达到15.7%,GPA+CD36+细胞为6.06%,而种植进海藻酸钠水凝胶的细胞培养十天后的GPA+细胞为 3.17%,GPA+CD36+细胞为 0.89%。hESCs来源的造血干/祖细胞悬浮培养十天后的GPA+细胞达到35.7%,GPA+CD36+细胞为27.7%,但种植进胶原蛋白水凝胶内的GPA+细胞为11.1%,GPA+CD36+细胞为 5.19%。hESCs来源的造血干/祖细胞悬浮培养十天后的GPA+细胞达到15.7%,GPA+CD36+细胞为6.06%,但透明质酸水凝胶为GPA+细胞为19.6%,GPA+CD36+细胞为6.52%。二、细胞培养:1.脐带血:不同培养条件下,两者红系细胞总数相差不大,但透明质酸组的GPA+、GPA+CD36+、GPA+CD71+细胞总数是悬浮培养组的3.7倍、3.9倍、5.1倍。免疫荧光染色证实透明质酸组水凝胶内培养的细胞确实是红系细胞,且具有一定的成熟功能。2.hESCs:将细胞进行实验前,来源于mAGM-S3/hESCs共培养第12天的GPA+细胞为36.8%,细胞量为0.6×106个。而进行悬浮培养和三维培养十天培养后,悬浮培养组获得的红系细胞量为3.9×105个、透明质酸组为4.2×105个。hESCs来源的红系细胞总数相差不大,但透明质酸组的GPA+细胞数是对照组的1.59倍,GPA+CD36+细胞总数是对照组的2.68倍,GPA+CD36+细胞总数是对照组的1.54倍,GPA+CD71+细胞总数是对照组的2.68倍,GPA+CD71-细胞总数是对照组的1.44倍。结论:1.BeaverNano水凝胶、海藻酸钠水凝胶、胶原蛋白水凝胶建立的三维培养方法不利于红系细胞生长,而透明质酸水凝胶建立的三维培养方法有利于红系细胞生长。2.透明质酸水凝胶能促进脐带来源或hESCs来源的造血干/祖细胞向红系细胞诱导分化。3.流式结果提示透明质酸水凝胶选择性促进幼稚红系细胞诱导分化。