背景Ⅱ型心肾综合征(type Ⅱ cardio-renal syndrome,Ⅱ型CRS)是慢性心力衰竭(Chronic Heart Failure,CHF)导致的慢性肾损伤,具有高发病率、高死亡率的特点,已经成为国内外研究的热点。目前认为炎症反应贯穿于Ⅱ型CRS发生发展的全程。而microRNA(miRNA)对炎症反应有重要调控作用。miRNA调节炎性反应蛋白表达,产生心肾损害,是Ⅱ型CRS的重要发病机制。然目前与Ⅱ型CRS发病相关的miRNA尚不十分明确。我们前期研究显示阳虚证与CRS有显著相关性和相似的远期预后。因此我们认为心肾阳虚是Ⅱ型CRS的主要证候特征,CHF向CRS的发展过程,是心阳亏虚,心损及肾,心肾同病的过程,而心肾相关是心肾渐次发生功能和物质损害的病理基础,且心肾相关的微观物质基础可能与调控Ⅱ型CRS发生发展的miRNA有关。因此积极寻找与Ⅱ型CRS发病相关的miRNA,及其调控的细胞信号通路和炎症因子,不但对深化Ⅱ2型CRS的发病机制、开展疾病防控有重要意义,而且有助于揭示心肾相关的微观物质基础,为心肾相关理论提供科学依据。目的本研究通过比较阳虚型CHF与阳虚型Ⅱ型CRS患者炎症相关miRNA、炎性反应标记物、临床基础资料之间的差异,并比较差异资料之间的相关性,初步勾勒出以miRNA为核心调控链对Ⅱ型CRS发病的影响。期望证实在CHF向CRS发展过程中,心肾从基因水平、蛋白质水平对于炎性反应有密切的调控作用,从而影响器官及整体水平,在表观上表现为心阳虚向心肾阳虚发展,并以此作为心肾相关的客观依据之一,阐明心肾相关理论在阳虚型Ⅱ型CRS中的发病机理。有助于从中医理论层面寻找防止或延缓CHF向CRS发展的可能靶点,有针对性地进行干预,防止疾病传变。同时,通过本研究可能明确心肾之间具有辨证价值的调控链条,对于丰富和发展中医理论具有一定意义。方法收集2017年1月至2018年1月于中国中医科学院广安门医院心内住院的阳虚型CHF患者65例和阳虚型Ⅱ型CRS患者82例,并收集健康人20例。1.两组患者临床基础资料收集采集患者一般临床资料,包括姓名、性别、年龄、病程、合并疾病、合并用药、临床基础化验检查指标,包括血常规(红细胞、白细胞、血红蛋白、血小板)、生化指标(血脂、尿酸、电解质、肝肾功能)、血气、甲功;心功能指标(NYHA心功能分级、NT-proBNP、心脏彩超)。同时收集20例健康人的血常规、生化指标作为对照,比较各组之间临床基础资料的差异。2.两组患者炎症因子表达检测对入选的CHF和CRS组各50例患者及健康人20例进行炎症因子检测。包括CRP(免疫比浊法检测);CA125(化学发光免疫法检测);Renin、ATⅡI、ALD(放射免疫分析法检测);运用ELISA法检测各组外周血IL-1β、IL-18、TNF-α、NF-κB、TLR4表达水平;运用RT-PCR技术检测CHF组16例,CRS组16例和8例健康人PBMC中NF-KBmRNA、TLR4mRNA表达水平,并比较其差异。3.两组患者外周血miRNA表达谱检测和生物信息分析选取健康人5例、CHF组和CRS组各5例患者,使用IlluminaHiSeq X Ten仪器进行高通量测序,在全基因组范围内筛选健康组与CHF组、健康组与CRS组,CHF与CRS组患者外周血miRNA表达谱,并从中筛选CHF组与健康祖,CRS组与健康组表达差异的miRNA(变化量>2倍,P<0.05),并进一步筛选CHF组与CRS组差异表达明显的miRNA(变化量>2倍,P<0.05),之后利用RNAhybrid和Miranda软件,来预测差异表达miRNA的靶基因,并通过对差异miRNA的预测靶基因进行GO注释和KEGG通路分析,初步了解候选靶基因发挥的主要生物学功能及参与的主要生化代谢途径和信号传导通路。结果1.两组患者相关临床基础资料结果临床基础资料分析结果显示,CRS组在年龄、性别(女性)、合并高血压方面与CHF组比较存在极显著差异(P<0.01),而与合并症是否房颤,是否糖尿病、是否高脂血症以及CHF病程无关(P>0.05)。高龄、女性、合并高血压患者更容易发生CRS;生化分析结果显示,与CHF组比较,CRS组血肌酐、尿素氮、血尿酸、血小板、直接胆红素、血磷、总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、极低密度脂蛋白水平明显高于CHF组(P<0.01或0.05),而血红蛋白、血钙、PH值、HC03-水平明显低于CHF组(P<0.01或0.05);心功能分析结果显示,与CHF组比较,CRS组NYHA心功能分级、NT-proBNP水平、左室壁厚度明显升高,LVEF显著降低(P<0.01或0.05)。2.两组患者炎症因子结果(1)与健康组比较,CHF组和CRS组外周血炎症细胞因子CRP、Renin、ATⅡ、ALD、CA125、IL-1 β、IL-18、TNF-α、NF-κBp65、TLR4 含量明显升高(P<0.01或 0.05);(2)与CHF组比较,CRS组外周血炎症因子CRP、IL-1β、IL-18、TNF-α、NF-κB、TLR4 表达明显升高(P<0.01 或 0.05);而 Renin、ATⅡ、ALD、CA125两组之间比较,统计学无明显差异(P>0.05);(3)与健康组比较,CHF组与CRS组NF-κBmRNA和TLR4mRNA表达均显著上调(P<0.01 或 0.05);与 CHF 组比较,CRS 组NF-κBmRNA、TLR4mRNA表达上调更明显(P<0.05)。3.两组患者microRNA表达谱及生物信息分析结果通过高通量测序成功构建各组miRNA表达谱。(1)CHF组与健康组比较,共筛选出差异miRNA有1366种,其差异表达明显的miRNA共有238种(变化量>2倍,P<0.05),其中上调116个,下调122个。其中差异表达量10倍以上的miRNA有177种(P<0.01);(2)CRS组与健康组比较,共筛选出差异miRNA有1084种,其差异表达明显的miRNA共有265种(变化量>2倍,P<0.05),其中上调161个,下调104个。其中差异表达量10倍以上的miRNA有187种(P<0.01);(3)CHF组和CRS组比较,共筛选出差异miRNA有1271种,其中差异表达的miRNA共有34种(变化量>2倍,P<0.05),其中上调17个,下调17个。差异表达量10倍以上的miRNA有10种(LogFC>3.3或<-3.3,P<0.05)。其中上调 5 个,由高到低依次为 miR-30c-5p、miR-223-3p、miR-4692、miR-3196、miR-7851-3p;下调 5 个,由高到低依次为 miR-5587-5p、miR-4283、miR-3140-3p、miR-4447、miR-6876-3p。同时采用RNAhybrid和Miranda软件,对34个差异显著miRNA进行靶基因预测,共得到2692个候选靶基因,其中包含NF-κB、TLR4、SMAD6、TIAF1、NRF1、AQP7、PAK3等文献报道的与心肾损伤相关的靶基因。针对这些预测靶基因进行GO及KEGG分析,并与参考基因组进行对比发现,在生物进程方面,差异表达的miRNA的候选靶基因显著富集于包括Wnt signaling pathway、NF-κ appaB singaling pathway、apoptotic signal pathway、p38MAPK cascade、Toll signaling pathway、positive regulation of STAT protein import into nucleus等等667条通路;在分子功能方面,差异表达的miRNA的候选靶基因显著富集于protein binding、kinase activity、metal ion binding等200条通路;在细胞组分方面,差异表达的miRNA的候选靶基因显著富集于cell junction、synapse、dendrite等141条通路。KEGG分析鉴定出包括MAPK signaling pathway、cGMP-PKG signaling pathway、Wnt signaling pathway、mTOR signaling pathwy、Notch signaling pathway、NF-κ appa B signaling pathway、TNF signaling pathway等相关通路在内的90条显著富集的KEGG信号通路。对本课题重点关注的NF-κB pathway与候选靶mRNA和差异miRNA的关联分析,发现参与NF-κB信号通路的靶mRNA有41种,主要为炎症相关的mRNA,包括TNF、IL、TLR4、CCL等家族;参与NF-κB信号通路调控的miRNA有18种。其中有16种均为高通量测序得出的差异miRNA。7种miRNA表达上调,分别是miR-4692、miR-6126、miR-143-3p、miR-3591-3p、miR-574-3p、miR-345-5p、miR-3196。9种miRNA表达下调分别是miR-4447、miR-6876-3p、miR-4458、miR-4485-5p、miR-92b-5p、miR-4283、miR-6841-3p、miR-6819-5p、miR-6512-3p;其中与上调基因miR-4692、miR-3196和下调基因miR-4283、miR-4447关系最为密切(变化量>10倍,P<0.01)。结论1.高龄、女性、高血压病史是Ⅱ型CRS发生的高危因素。随着血尿酸、血脂、血小板、直接胆红素、血磷、左室壁厚度升高,血Hb、血钙、PH值、HC03-降低和心功能恶化,Ⅱ型CRS的发病率呈逐渐升高趋势。临床上应重视对上述危险因素的早期识别和控制,以延缓Ⅱ型CRS的发生发展;2.CHF发生后因血流动力学改变、神经内分泌过度激活等因素导致miR-4692、miR-3196表达上调,miR-4283、miR-4447表达下调;继而导致下游TLR4/NF-κB信号通路过度激活,导致促炎因子CRP、IL-1β、IL-18、TNF-α释放入血,最终导致肾损害,是介导Ⅱ型CRS发生的重要炎症信号通路之一;3.MiR-4692、miR-3196、miR-4283、miR-4447 靶向调控 TLR4/NF-KB 信号通路过度激活是介导Ⅱ型CRS炎症反应的关键环节,可能是心衰从心阳虚发展到肾阳虚,引起心肾同病的分子机制,也可能是心肾相关理论在阳虚型Ⅱ型CRS中的发病机理;4.11型CRS发病还可能与p38MAPK信号通路、Wnt信号通路激活介导的肾脏纤维化和重构有关。