本文从3-4日龄的SD大鼠颅盖骨中分离获得威骨细胞(osteoblast，OB)，采用第2-3代的OB研究1α，25-(OH)2D3对OB增殖分化、细胞周期、[Ca2+]i以及超微形态结构的影响，为研究1α，25-(OH)2D3对骨代谢性疾病的防治提供理论依据。 1、成骨细胞的培养与鉴定 为研究各种因子对骨代谢性疾病影响的部分机制，选取3-4日龄SD大鼠颅盖骨，采用胰酶、胶原酶两步消化法获得OB，80％融合后传代。倒置显微镜下观察OB的形态及生长情况，碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)和茜素红矿化结节染色特异性鉴定OB，MTT法测定OB的生长周期。结果，本方法分离的OB生长状态良好，纯度较高，能满足一般试验的需要。 2、1α，25-(OH)2D3对体外培养成骨细胞增殖分化的影响 为研究1α，25-(OH)2D3对体外培养OB增殖分化的影响，在体外分离SD大鼠乳鼠颅盖骨获得OB培养基础上，细胞传代培养，待80％融合后，添加不同浓度1α，25-(OH)2D3作用1、3、5d，通过MTT法观察细胞增殖，对硝基苯磷酸二钠(p-nitrophenyl phosphate，PNPP)法检测细胞培养液中ALP活性。结果，1、3、5d时，添加1α，25-(OH)2D3各组OB增殖均受抑制，10-8、10-7 mol/L组差异极显著(P<0.01)。1d时不同浓度1α，25-(OH)2D3组ALP活性均极显著高于对照组(P<0.01)；3、5 d时，10-7 mol/L组ALP活性明显降低，与对照组差异极显著(P<0.01)，其余各组间差异不显著(P>0.05)。说明1α，25-(OH)2D3对OB增殖具有抑制作用，低浓度抑制OB分化，高浓度促进OB分化。 3、1α，25-(OH)2D3对体外培养成骨细胞周期及[Ca2+]i的影响 在体外培养SD大鼠乳鼠颅盖骨OB基础上，添加不同浓度的1α，25-(OH)2D3(0、10-9、10-8、10-7 mol/L)，作用20 min、24 h，分别测定[Ca2+]i，48 h后，碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色，流式细胞仪分析细胞周期。结果，20 min时，不同浓度1α，25(OH)2D3组[Ca2+]i均显著高于对照组(P<0.05)，24 h时10-9 mol/L1α，25(OH)2D3组[Ca2+]i则显著低于对照组(P<0.05)，其余各组间差异不显著(P>0.05)；作用48 h后，10-9、10-8、10-7mol/L1a，25-(OH)2D3组OB滞留在G2/M期，表明1α，25-(OH)2D3抑制OB增殖。 4、1α，25-(OH)2D3对体外培养成骨细胞超微形态结构的影响 在体外培养SD大鼠乳鼠颅盖骨OB基础上，添加不同浓度的1a，25-(OH)2D3，作用48 h后，透射电镜、扫描电镜观察各组OB的超微形态结构。结果表明，与对照组相比，10-9 mol/L1a，25-(OH)2D3组细胞铺展较好，表面突起、线粒体数量增多；10-8 mol/L1a，25-(OH)2D3组细胞趋于扁平，表面突起减少且呈现细长状，内质网数量增多，线粒体减少；10-7 mol/L1a，25-(OH)2D3组细胞外基质中大量丝状纤维连接成网状，胞内细胞器较少，出现大量空泡，胞浆内含有大量钙颗粒沉积。说明，随着1α，25-(OH)2D3浓度的增加，细胞趋于扁平，更利于与骨表面接触，从细胞超微形态结构来说明高浓度1α，25-(OH)2D3能够抑制OB增殖，促进OB的分化及功能表达。