Paenibacillus polymyxa SIIA-1408产抗菌活性物质的研究

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多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)是一类对植物无致病性且具有促进生长作用和预防虫害作用的应用潜力非常大的植物根际促生菌和生防菌种,可以产生多种具有不同抗菌活性的物质。随着革兰氏阴性菌的耐药形势日益严峻,人们对多粘类芽孢杆菌尤其是产生多粘菌素的多粘类芽孢杆菌的关注度越来越高。因此,对其产生的抗菌活性物质的研究就显得尤为重要。本文通过对芽孢杆菌SIIA-1408进行分类鉴定及其代谢产物的研究,分离、纯化得到多粘菌素E的两个单组分及一种广谱抗菌活性的物质,确定了其化学结构。主要的研究内容包括以下几个方面:(1)通过培养特征、形态特征、一些常规的生理生化特征及16s RNA基因序列分析构建系统发育树种等方法对芽孢杆菌SIIA-1408进行分类鉴定,确定了其归属为Paenibacillus属Paenibacillus polymyxa种细菌。(2)对Paenibacillus polymyxa SIIA-1408的发酵液的抗菌活性进行分析,结合相关文献报道和分析方法及购买的标准品,初步确定发酵液中主要抗菌活性组分的成分。基于该结果,选择合适的发酵液预处理方法,对其初步分离工艺、反相硅胶柱层析工艺进行了研究,并结合制备色谱的方法分离得到两个纯度在92%以上的组分。通过高分辨质朴分析其化学式分别为C53H102N16O13、C52H100N16O13,分别与多粘菌素E1和E2相同。在此基础上,对Paenibacillus polymyxa SIIA-1408进行纯种分离,筛选出了一株多粘菌素产量高且遗传稳定性好的菌株SIIA-1408-28,并通过等离子体诱变和NTG复合诱变,以发酵液中多粘菌素E的产量为指标进行筛选获得了一株多粘菌素产量高且遗传稳定性良好的菌株SIIA-1408-28-22-30,其多粘菌素产量可达16341.2μg/mL。最后在摇瓶种对SIIA-1408-28-22-30产生多粘菌素的发酵条件进行了优化研究,考察了摇瓶的接种时间、接种量、装样量、发酵液的初始pH、摇床转速、发酵温度、发酵周期的影响。通过单因素实验确定最佳培养基组分为葡萄糖、玉米淀粉、黑豆粉、(NH4)2SO4、NH4H2PO4、MgSO4、CaCO3、消泡剂。在单因素实验的基础上,通过正交试验优化了培养基组分比例:优化后的培养基配方为:葡萄糖20.0 g/L、玉米淀粉70.0 g/L、黑豆粉30.0 g/L、(NH4)2SO4 20.0 g/L、NH4H2PO4 0.6 g/L、MgSO4 0.05 g/L、CaCO3 1.0 g/L、消泡剂0.9 g/L。多粘菌素的产量达到20352.7μg/mL左右。(3)在Paenibacillus polymyxa SIIA-1408-28-22-30产多粘菌素E的培养基优化过程中发现不添加NH4+多粘菌素的产量明显降低,而此时另一具有广谱抗菌活性的物质SIIA-1408-X的产量却比较高。研究发现向其初始发酵培养基中添加苯丙氨酸,SIIA-1408-X产量大幅度增加,而添加(NH4)2SO4等含铵盐后苯乳酸的产量则会大幅度降低。对其初步分离、纯化工艺、反相硅胶柱层析工艺进行了研究,结合制备色谱及结晶的方法得到了其晶体,通过正、负离子质谱及单晶衍射分析确定了其具体结构为(S)-2-羟基-3-苯基丙酸,即苯乳酸。
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