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除虫菊酯,包括除虫菊酯I-II、瓜叶菊酯I-II、茉酮菊酯I-II,是从除虫菊(Chrysanthemum cinerariaefolium)干花中提取出来的一种高效、低毒、广谱、低残留的天然杀虫剂。目前,国际上大量分析鉴定除虫菊酯的方法,包括气相色谱GC、液相色谱HPLC等,设备要求高,操作严格,前处理复杂,不适合于现场快速检测。免疫分析方法因其具有测试费用低、可现场快速检测等优点,是一种很有前景的检测方法。重组抗体,包括Fab,scFv,Fv,VHH等,是一种新型的免疫检测试剂,具有亲和力高,特异性强,检测限低,易于在原核系统中大量表达等优点。目前,抗除虫菊酯的重组抗体尚未见报道,因此,研究抗除虫菊酯的重组抗体对建立免疫学检测方法或开发生物传感器都具有十分重要的意义。本研究结合重叠PCR和差减噬菌体展示构建了抗除虫菊酯的scFv文库,并进行初步筛选,为后续免疫方法研究奠定了基础。主要研究结果如下:①通过优化重叠PCR扩增抗除虫菊酯的单链抗体DNA文库。以除虫菊酯6种单体的混合抗原免疫BALB/c小鼠制备抗血清,用间接ELISA检测抗体效价达到105以上;分离脾细胞,提取mRNA反转录成第一链cDNA,用PCR分别扩增VH(380 bp)和VL(660 bp)可变区片段;通过Linker加端和重叠PCR组装成抗除虫菊酯的长链(780 bp)和短链scFv基因(750 bp)。②利用噬菌体展示构建抗除虫菊酯的长、短链scFv抗体文库。通过Sfi I位点将scFv基因与pComb3H载体连接,电转化大肠杆菌XL1-Blue,获得阳性克隆,库容分别达到了1.3×107和2.6×107;利用辅助噬菌体VCSM13进行超感染,获得抗除虫菊酯噬菌体文库滴度分别达到了1×1012和7.5×1012 cfu。③采用4轮连续筛选富集抗除虫菊酯的噬菌体抗体文库。对长、短链噬菌体文库分别进行4轮梯度筛选,测定文库回收率分别得到了50和44倍的富集,并用ELISA对筛选效果进行检测;用Bst NI限制性酶对最后一轮富集的抗体文库进行指纹分析,长、短链抗体文库的多样性约为40～50%。④利用噬菌体ELISA筛选抗除虫菊酯6种单体的单克隆抗体。从最后一轮筛选文库中分别挑取96个单克隆进行噬菌体抗体上清的培养,用ELISA分别筛选抗除虫菊酯6种单体的单克隆;从长链文库中筛选到了25个特异性结合除虫菊酯的单克隆,其中,3和5个克隆特异性结合除虫菊酯I-II;5和7个克隆特异性结合瓜叶菊酯I-II;7和3个克隆特异性结合茉酮菊酯I-II;进一步从短链文库中筛选到了15个抗除虫菊酯I-II的单克隆,其中,9个克隆显示对除虫菊酯I的抗体活性;7个克隆显示对除虫菊酯II的抗体活性;此外,在不同单体之间存在交叉反应。