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目的糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病较为严重的并发症之一,其发病机制涉及炎症、氧化应激等因素。近年来,有研究表明,肾脏炎症对促进DN发展至关重要,炎症可能是DN中刺激已知的生化和代谢紊乱的关键因素。尽管炎症已经被认为是DN发生、发展中的一个重要环节,但其具体机制仍无定论,目前的诊治手段仍不理想。近年来通过全转录组测序技术,鉴定了许多的长链非编码RNA(lncRNA),其长度超多200个核苷酸,且缺乏蛋白编码能力,越来越多的证据表明,长链非编码RNA可以通过与蛋白质或者RNA相互结合参与许多生理或病理过程。长链非编码RNA的异常表达与包括糖尿病肾病在内的许多疾病相关,我们通过RNA测序发现了在糖尿病肾病中差异表达的lncRNAs,在这些lncRNAs中,我们用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRTPCR)技术在体内和体外鉴定了七个与DN相关的lncRNA,包括显著表达的lncRNA Rpph1。此外,我们研究LncRNA Rpph1在DN小鼠肾脏组织以及高糖和低糖培养的小鼠肾小球系膜细胞中的表达水平,检测Rpph1在高糖和低糖培养的系膜细胞中的亚细胞分布情况,以及预测长链非编码RNA Rpph1的非编码性。结果显示在过表达或者下调Rpph1之后可以调节系膜细胞(mesangial cells,MCs)炎症因子的表达和细胞增殖。RNA-pulldown和质谱结果显示Rpph1与DN相关因子Galectin-3(Gal-3)直接相互作用,在低糖培养系膜细胞中,Rpph1过表达后可通过Gal-3/MEK/ERK信号通路促进MCs炎症和细胞增殖,而在高糖条件下培养的系膜细胞中,Rpph1的下调通过Gal-3/MEK/ERK通路抑制MCs的炎症反应和细胞增殖。总的来说,这些结果关于Rpph1与Gal-3/MEK/ERK信号通路的关系为DN发生发展提供了新的见解。方法采用高通量测序技术(RNA sequencing,RNA-seq),检测糖尿病肾病小鼠以及正常小鼠的肾脏组织中差异表达的lncRNAs,发现有95个lncRNAs差异表达,其中有46个表达上调,49个表达下调。根据FPKM>150,FC>2筛选出7个表达差异最明显的lncRNAs,采用qRT-PCR检测这7个lncRNAs在糖尿病肾病小鼠肾脏组织中和在高低糖条件下培养的系膜细胞中的差异表达,发现lncRNARpph1保守度最高,并且在糖尿病肾病小鼠肾脏组织和肾小球系膜细胞中差异表达最高,因此选lncRNARpph1作为本课题研究的对象。通过qRT-PCR和FISH方法检测lncRNA Rpph1在糖尿病肾病小鼠肾脏组织和系膜细胞细胞质和细胞核中的表达及分布情况。利用生物信息学网站ORF finder(www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)和CPAT(Coding-Potential Assessment Tool)(http://lilab.research.bcm.edu/cpat/)在线预测Rpph1蛋白编码情况,分析其蛋白编码潜能。构建pcDNA3.1(+)-Rpph1过表达质粒,设计并合成Rpph1 siRNAs。通过免疫组织化学技术、qRT-PCR、western blot、ELISA和免疫荧光检测糖尿病肾病炎症相关因子Tnf-α和Mcp-1在糖尿病肾病小鼠肾脏组织与系膜细胞中的表达,以及检测过表达及敲低Rpph1后对炎症相关因子Tnf-α和Mcp-1在糖尿病肾病小鼠肾脏组织和高低糖培养的系膜细胞中表达的影响。运用EdU检测过表达和敲低Rpph1后系膜细胞增殖的情况。为了进一步探索lncRNA Rpph1如何调控糖尿病肾脏肾小球系膜细胞炎症因子及细胞增殖的机制,通过RNA-pulldown及质谱法检测与Rpph1相互作用的蛋白,发现Rpph1与DN相关因子Galectin-3相互结合。设计并合成Gal-3siRNAs,构建Gal-3过表达质粒,检测转染Gal-3 siRNA和过表达质粒后对系膜细胞增殖的影响,运用western blot检测转染Gal-3 siRNA和过表达质粒后MEK/ERK通路相关蛋白MEK、p-MEK、ERK、p-ERK、c-Jun、p-c-Jun蛋白表达量,ELISA检测炎症因子Tnf-α、Mcp-1的表达,以及EdU检测Gal-3对系膜细胞增殖的影响。此外,在转染Rpph1过表达质粒和siRNA后,western blot检测MEK/ERK通路相关蛋白表达,并在低糖培养的系膜细胞中转染Rpph1过表达质粒和Gal-3 siRNA,以及在高糖状态下培养的系膜细胞中转染Rpph1 siRNA和Gal-3过表达质粒,western blot检测MEK/ERK通路相关蛋白表达,ELISA检测炎症因子Tnf-α、Mcp-1的表达以及EdE检测对系膜细胞增殖的影响。并且,我们在低糖培养的系膜细胞中转染MEK特异性抑制剂U0126,采用western blot检测MEK/ERK通路蛋白的表达情况。而且,我们设计和合成了Mek1和Mek2的siRNA,在高糖培养的系膜细胞中转染后运用western blot检测MEK/ERK信号通路蛋白的表达。结果lncRNA Rpph1在糖尿病肾病小鼠肾脏组织和在高糖条件下培养的系膜细胞中的表达相较与正常小鼠肾脏组织和低糖培养的系膜细胞中的表达显著上调,qRTPCR和FISH实验的结果显示lncRNA Rpph1在系膜细胞的细胞质和细胞核内均有分布,但主要在细胞质内表达,而在糖尿病小鼠肾脏组织中表达高于正常小鼠肾脏组织。通过ORF finder和CPAT软件在线分析Rpph1的蛋白编码能力,结果显示其不能编码蛋白。在高糖培养的系膜细胞中转染Rpph1的三条siRNAs,以及在低糖培养的系膜细胞中转染Rpph1过表达质粒,通过qRT-PCR实验筛选出干扰效率最佳的siRNA,其中Rpph1 siRNA3干扰效率最佳,并且结果显示pcDNA3.1(+)-Rpph1过表达质粒可显著提高Rpph1的表达。免疫组化和结果显示炎症相关因子Tnf-α和Mcp-1在糖尿病肾病小鼠肾脏组织中的表达显著高于正常小鼠肾脏组织,qRTPCR结果提示在高糖培养的系膜细胞中Tnf-α与Mcp-1相较于低糖培养的系膜细胞其表达上调。Western blot、细胞免疫荧光和ELISA结果显示Rpph1能显著上调Tnf-α和Mcp-1的表达,EdU结果显示Rpph1促进了系膜细胞增殖。此外,RNA-pulldown和质谱检测提示Rpph1与Gal-3相互结合,且通过MEK/ERK信号通路促进了糖尿病肾脏炎症因子的表达和系膜细胞增殖,在低糖培养的系膜细胞中转染Rpph1过表达质粒和Gal-3 siRNA后,western blot、EdU及ELISA结果显示Gal-3 siRNA能逆转Rpph1促进系膜细胞炎症因子的表达及增殖的作用;同样,在高糖培养的系膜细胞中转染Rpph1 siRNA和Gal-3过表达质粒后,结果显示Gal-3过表达后能逆转Rpph1 siRNA抑制系膜细胞炎症因子表达及增殖的作用。并且,在转染MEK特异性抑制剂后,其阻断了Rpph1和Gal-3促进系膜细胞炎症因子Tnf-α和Mcp-1的表达以及对系膜细胞的增殖的作用。结论在糖尿病肾病小鼠肾脏组织和高糖培养的系膜细胞中,lncRNA Rpph1显著高表达,且Rpph1能通过M E K/E R K信号通路调控糖尿病肾病肾脏肾小球系膜细胞的增殖及炎症因子的表达。由此可以推断lncRNA Rpph1有可能参与糖尿病肾病的发生与发展,为糖尿病肾病系膜细胞炎症和增殖提供一个有趣的方向。