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L-乳酸是一种重要的有机酸,广泛应用于食品、医药和化工领域。近年来,随着可生物降解聚乳酸(poly-lactic acid, PL A)的广泛应用,国内外L-乳酸的需求呈逐年上升。微生物发酵法生产乳酸由于生产成本低、产品光学纯度高、安全性高,被广泛用来生产乳酸,而构建高产L-乳酸的工程菌是微生物发酵法生产乳酸的关键。本文主要以己敲除多个产杂酸酶基因的大肠杆菌工程菌Escherichia coli SZ470(△frdBC△ldhA△acka△focA-pflB△pdhR::pflBp6-pflBrbs-aceEF-lpd)为起始菌株,利用RED重组系统敲除其乙醇脱氢酶基因,利用染色体插入技术进一步插入带有自身启动子的乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)的L-乳酸脱氢酶基因来构建能利用五碳糖同型发酵高纯度L-乳酸的重组大肠杆菌Escherichia coli WL201,并通过无氧管驯化Escherichia. coli WL201菌株得到E. coli WL202。进一步研究工程菌WL202对不同糖的利用情况及发酵条件。结果发现,WL202发酵6%的葡萄糖,乳酸的产量达到41.13g/L,葡萄糖的最大消耗速率为1.46g/(L·h)；发酵6%木糖乳酸的产量达到34.73g/L,木糖的最大消耗速率为0.88g/(L·h)。两种糖的发酵产物中都未检测到琥珀酸、甲酸的生成,仅有少量乙酸生成。在木糖发酵时L-乳酸纯度最高,可达95.69%(L-乳酸在总发酵产物的比率)。在30g几木糖和30g/L葡萄糖混合碳源发酵时,工程菌WL202优先利用葡萄糖,当葡萄糖浓度低于1.56g/L后,菌体开始利用木糖进行乳酸发酵,得到39g/L乳酸。在培养基中添加0.25g/L的Mg2+可以使WL202利用木糖产L-乳酸的产量提高18%,提高到38.]8g/L。在高纯度产L-乳酸的大肠杆菌工程菌Escherichia coli WL202的基础上,构建了乳酸片球菌的L-乳酸脱氢酶基因的过量表达体系。重组大肠杆菌Escherichia coli WL202(pET-28a-ldhL-)能以7%的木糖为碳源进行厌氧发酵,相对于出发菌株Escherichia coli WL202, Escherichia coli WL202(pET-28a-ldhL)发酵木糖的糖酸转化率提高了20%,乳酸产量达到了64g/L。最后,对WL202进行耐高糖浓度及适应无机盐培养基的驯化。高糖浓度驯化的菌株WL205可在LB培养基中利用木糖生产62g/L乳酸,最高产率约为0.78g/L,糖酸转化率为97%。适应无机盐培养基驯化得到了菌株WL210,其在加有0.2%的LB中可出生长良好,以7%的木糖为碳源发酵罐发酵,WL210的最大OD600为4.56.乳酸产量为56.09g/L.光学纯度高达99%。WL210在无机盐培养基中L-乳酸发酵产量与LB培养基相差不大考虑到无机盐成本较低,使菌株WL210在L-乳酸生产上具有较大的工业化应用价值。