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研究背景高级别神经胶质瘤,尤其是胶质母细胞瘤（Glioblastoma,GBM）是最常见的恶性脑肿瘤。因其侵袭性强,难以做到手术全切,故复发率较高。在GBM术后辅助治疗中,替莫唑胺（Temozolomide,TMZ）是GBM常用的一线化疗药物,其对免疫检查点的影响已有一定研究,但十分有限。鉴于免疫检查点抑制剂单一用药对于GBM的治疗效果有限,更好地了解替莫唑胺对免疫环境的影响,从而联合替莫唑胺与免疫检查点抑制剂以达到更好的协同治疗作用,对于扩展免疫治疗的用途,指导临床用药有很大的意义。B7-H4（也称为B7x或B7-S1）与PD-L1（又称B7-H1）一样,都是T细胞共刺激和共抑制家族-B7家族的成员。从功能上讲,B7-H4可以对T细胞的活化和增殖产生抑制效应。B7-H4的高表达在人类多种癌症组织中被检测到,并且通常与不良预后有关。关于TMZ和PD-L1药物的协同作用有一定的报道,其效果已被验证,但这远远不够。复旦大学附属华山医院周良辅团队近期报道发现,B7-H4在GBM中是一个重要的免疫检查点,并且在表达上B7-H4和PD-L1是相互独立的两个免疫检查点。我们推测,TMZ对免疫检查点的调控不仅局限于PD-L1分子上,还可能作用于其他免疫检查点如B7-H4。如何提高免疫治疗的敏感性是一大难题。TMZ和抗PD-L1药物结合治疗方案适用于高PD-L1表达者,而高B7-H4表达者可能需要TMZ及抗B7-H4药物的联合治疗,以提高不同亚型的治疗敏感性。TMZ是否可对B7-H4进行调控,以及TMZ与抗B7-H4的结合是否可对高表达B7-H4的GBM亚型群体疗效更好,甚至优于TMZ和PD-L1抗体结合的疗效,这是本论文在临床前研究中所关注的科学问题。目的本实验目的是进行替莫唑胺调控胶质瘤细胞中B7-H4表达的研究,利用GBM细胞模型在体外和体内探究TMZ对B7-H4的表达调控以及TMZ与B7-H4抗体联用对GBM原位移植瘤的抑制作用有望指导B7-H4阳性细胞亚型的治疗,为潜在的临床试验提供理论基础。方法1.体外培养GL261细胞和T98G细胞,将其分为对照组、TMZ200μmol/L（μM）组、TMZ400μM组及TMZ800μM组,通过流式细胞术（flow cytometry,FACS）,蛋白质免疫印迹方法（Western blot,WB）和实时荧光定量PCR（Real-time q PCR,RT-q PCR）检测PD-L1,B7-H4的表达。2.为研究TMZ对B7-H4的调控机制,将GL261细胞、T98G细胞分为对照组,TMZ200μM组、TMZ400μM组、JAK抑制剂（JAKi）组、JAKi+TMZ200μM组、JAKi+TMZ400μM组,通过WB方法测定B7-H4,信号转导和转录激活因子3（STAT3）,磷酸化的信号转导和转录激活因子3（p-STAT3）的表达。3.生信分析部分通过STRING网站研究B7-H4相关蛋白,GEPIA2网站查找B7-H4相关基因,并通过Metascape网站进行基因富集分析,研究B7-H4可能相关的信号通路。4.构建GL261-LUC细胞及C57BL/6小鼠原位脑胶质瘤模型,为开展体内实验建立平台。5.采用IBM Statistics SPSS 21.0统计软件,两组计量资料之间比较采用独立样本t检验,P＜0.05被认为差异有统计学意义。用Image J软件进行灰度值分析,Flow Jo10.1软件进行流式细胞学的数据分析,用Graph Pad软件绘制统计图。结果1.TMZ促进小鼠及人胶质瘤细胞系PD-L1,B7-H4表达。通过流式细胞术和蛋白质免疫印迹方法检测蛋白表达,发现与对照组相比,TMZ组可明显升高GL261细胞膜表面PD-L1（P＜0.05）、B7-H4（P＜0.05）表达及T98G细胞膜表面B7-H4（P＜0.05）表达,且在0-400μM范围内,随着TMZ浓度升高,PD-L1和B7-H4表达逐渐升高。实时荧光定量PCR结果显示TMZ对GL261细胞系B7-H4表达的调控发生在转录水平。2.TMZ对B7-H4的调控可能不是通过STAT3起作用。TMZ不能上调GL261和T98G细胞中p-STAT3水平,推测TMZ对B7-H4表达的调节并不是通过JAK-STAT3通路发挥作用的。3.通过生信分析,找到了B7-H4潜在的调控机制。从STRING网站获得了已通过实验确定的B7-H4的前十名结合蛋白,可以发现B7-H4与免疫反应关系密切。GEPIA2探究与B7-H4最密切相关的100个基因。将前100个基因上传到Metascape网站得到富集分析的结果,找到了B7-H4可能潜在的调控机制。4.成功构建了GL261-LUC细胞及C57BL/6小鼠原位脑胶质瘤模型。将Luciferase慢病毒感染到GL261细胞内,成功筛选并构建了GL261-LUC细胞。随后用GL261-LUC注射到C57BL/6小鼠脑中,成功构建小鼠原位脑胶质瘤模型。结论1.细胞层面,TMZ在0-400μM范围内以剂量依赖的方式上调GL261和T98G细胞中PD-L1和B7-H4蛋白表达水平。2.在机制上,TMZ对B7-H4的表达上调可能不是通过JAK/STAT3通路发挥作用。通过生信分析,找到了B7-H4潜在的调控机制。3.成功构建了GL261-LUC细胞及C57BL/6小鼠原位脑胶质瘤模型,为下一步动物体内实验做准备。