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目的： 1.收集温州医学院各大合作医院门诊患者的临床资料，了解非综合征型听力损失(nonsyndromic hearing loss，NSHL)的发病情况。 2.通过统一的调查方法、标本采集，利用基因诊断方法对门诊非综合征型耳聋患者及其家系成员进行线粒体12S rRNA基因和核基因GJB3口GJB6基因突变检测，绘制基因突变频谱，分析这3个基因突变在NSHI发病中的作用。 3.对携带有A1555G和C1494T突变的患者进行线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)全序列的扩增，寻找新的mtDNA继发突变、多态性位点及mtDNA单倍型分析。 4.通过对携带GJB3和GJB6基因突变的中国耳聋家系进行临床、遗传和分子生物学特征分析，探讨突变位点与耳聋的关系，为耳聋相关基因的筛查、耳聋诊断及预防提供依据。 方法： 1.收集温州医学院各合作医院耳聋患者血样318例。并进行详细的临床资料分析，建立临床和分子遗传学资料数据库。 2.采集无亲缘关系正常对照人群血样本。 3.提取所采集血液样本的全基因组DNA。 4.通过聚合酶链反应(polymerise chain reaction，PCR)扩增技术对线粒体12SrRNA和核基因GJB3、GJB6基因区域进行突变筛查。 5.PCR产物纯化后直接进行测序分析。 6.绘制非综合征型耳聋患者线粒体12S rRNA和核基因GJB3、GJB6基因突变频谱。 7.对携带GJB3和GJB6基因突变的中国汉族耳聋家系进行系谱分析，收集临床相关资料并进行听力学检查，分析其他可能的因素对这些家系耳聋外显率的影响。 结果： 1.对已收集的318例门诊非综合征型耳聋患者进行线粒体12S rRNA基因筛查，共检测出线粒体12S rRNA基因上34个已知的突变位点，其中A1555G、C1494T和T1095C突变分别占9.1％、0.6%和1.25%。其中A839G和T1452C突变位于12S rRNA基因的高度保守区域且未在正常对照中发现，可能增加了耳毒性药物的敏感性。 2.对已收集的318例门诊非综合征型耳聋患者进行核基因GJB3和GJB6突变筛查，共发现GJB3基因上10个变异(5个为新变异)位点。其中6个(G250A，C301T，C310T，A544T，G547A，G580A)为错义突变，4个(G57A，C243T，C357T，C798T)为无义突变。结构和系统发育分析显示新变异C301T、A544T突变和已知变异G547A、G250A突变位于GJB3基因高度保守区域且没有在正常对照人群中发现，可能与非综合征型耳聋相关。其他变异可能为多态性变异。携带GJB3基因变异的13位患者中，只有1例携带C243T变异的患者携带了GJB2基因235 delC杂合突变。 3.318例门诊非综合征型耳聋患者GJB6基因突变筛查共发现2个变异位点，其中1个为228del G杂合突变，该突变导致终止密码子提前至第81位，翻译的多肽与野生型蛋白相比截短了181个氨基酸。在19个物种中进行Cx30氨基酸序列保守性分析证实，该位点保守性为100%；另外1例携带GJB6基因G630A杂合点突变，为同义突变L210L，保守性为94.7%。对照组中未发现这两种突变。 4.我们分析了线粒体12S rRNA基因和核基因GJB3和GJB6上各个突变位点与耳聋表型之间的关系；明确了中国NSHI门诊病例线粒体12S rRNA和核基因GJB3和GJB6的突变发生频率；绘制了中国NSHI人群线粒体12S rRNA基因和核基因GJB3和GJB6的突变频谱。 5.318例中国汉族NSHI人群中未发现同时携带线粒体12S rRNA、GJB3和GJB6基因变异的患者。 结论： 1.线粒体12S rRNA基因突变筛查发现，与药物性耳聋相关的A1555G突变有29例，C1494T突变只检测出1例，而在449名正常对照的线粒体DNA中并没有发现该突变，说明这两种突变是药物性耳聋的主要致病形式。线粒体DNA继发突变、线粒体DNA多态性及其他核修饰基因可能对这些耳聋家系的表型表达起到修饰作用。这些数据为氨基糖甙类抗生素耳毒性和非综合征型耳聋的预防和耳聋基因诊断的开展提供可靠的依据。 2.GJB3基因筛查发现的可能的致病突变均为杂合形式，提示GJB3基因可能以杂合突变形式影响中国人群听力情况，该基因突变患者的耳聋表型表达还可能与其他因素如线粒体单倍型、其它核修饰基因或环境等有关。我们的数据为研究中国汉族非综合征型聋病人群的致聋因素提供了有价值的信息和技术。 3.GJB6基因筛查共发现2例变异，说明GJB6基因突变在本研究人群中变异频率较低，可能是由于样本量不够大或GJB6基因在中国人群中突变率本身就低，有待于进一步扩大样本量来验证。对已发现的228 del G杂合突变的致病性，仍需要进一步功能验证。 4.本项工作为隐性遗传性非综合征型耳聋的分子诊断提供了可靠的方法，对聋病产前诊断、遗传筛查和遗传咨询提供理论依据，为开展耳聋疾病的基因诊断提供流行病学数据。