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洛美沙星(lomefloxacin,LMF)属于氟喹诺酮类药物(FQs),是一种人工合成的广谱高效抗菌药,因其具有广谱抗菌性及较强的杀菌作用,在畜禽养殖业中常用于治疗动物细菌和支原体感染。洛美沙星也是人医临床中的常用药,曾有关于服用洛美沙星后出现不良反应的报道。动物性食品中残留的洛美沙星一方面会通过食物链对人体造成危害,另一方面会造成日益严重的耐药性问题。因此,我国农业部于2015年颁布的2292号公告中明确指出禁止洛美沙星等相关制剂用于动物性食品中。针对洛美沙星残留的检测主要是使用一些理化方法,如紫外分光光度法、高效液相色谱法、荧光分光光度法、毛细管电泳法等。虽然这些理化方法可以对药物进行定量和定性的检测,但是操作过程较为复杂,对仪器设备依赖性高,所以不适用于现场检测大量的样品,所以建立一种快速检测洛美沙星残留的免疫学方法显得尤为重要。1.洛美沙星人工抗原的合成及鉴定本实验采用碳二亚胺法和混合酸酐法分别合成两种免疫原LMF-BSA(A)和LMF-BSA(B),用碳二亚胺法合成包被原LMF-OVA,经紫外扫描和SDS-PAGE分析后,可初步判定免疫原和包被原偶联成功。用合成的两种免疫原对小鼠行常规免疫,三免后采血经ELISA检测,血清抗体效价大于1:128000,证明人工抗原合成成功。BCA试剂盒测得 LMF-BSA(A)、LMF-BSA(B)和 LMF-OVA 分别为 5.39 mg/mL、4.82 mg/mL 和 5.05 mg/mL,紫外法测得三种人工抗原偶联比分别为6.1:1、2.7:1和6.5:1。2.抗洛美沙星单克隆抗体的制备与鉴定用合成的两种免疫原LMF-BSA(A)和LMF-BSA(B)分别对BALB/c小鼠进行常规免疫,在第五次免疫后7d采血并离心,对血清的效价及药物抑制进行测定。选取免疫效果较好的实验鼠进行细胞融合,然后采用有限稀释法配合间接ELISA进行细胞筛选,最终得到两株可持续分泌针对LMF单抗的杂交瘤细胞株,分别命名为3H8和7G4,将建株细胞注入小鼠腹腔诱生腹水,最后取得腹水14 mL。腹水经纯化后测得效价大于1:512000,单抗亚型为IgG1(轻链为Kappa链),该单抗与马波沙星、恩诺沙星、环丙沙星、沙拉沙星和阿莫西林交叉反应率极低。3.ELISA检测方法的建立将腹水纯化后,建立检测LMF残留的CiELISA的方法。摸索出该单抗的最佳抗原抗体工作浓度为包被原稀释4000倍,抗体稀释32000倍;最佳封闭液为0.5%的明胶。LMF浓度在LMF浓度在100～10000 pg/mL范围内,线性关系良好,线性方程为y=0.3671x-0.6172,相关系数 R2=0.9893,IC50 为1.10ng/mL,LOD 为 65.11 pg/mL,LOQ为 247.84 pg/mL。4.牛奶中LMF添加回收实验以鲜牛奶样品进行LMF添加回收实验,当对牛奶样品稀释16倍后,基本可除去牛奶样品中基质的干扰。LMF浓度在200～10000pg/mL范围内,线性关系良好,线性回归方程为y=0.4284x-0.877,相关系数R2=0.9923,IC50为1.64ng/mL,LOD为240.93pg/mL,LOQ为 416.38 pg/mL。用高(500 pg/mL)、中(5000 pg/mL)、低(8000 pg/mL)三种浓度的LMF溶液做药物添加回收实验,检测后计算得出鲜奶中洛美沙星的添加回收率在85.47%-104.54%。