背景：乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染可引起一系列肝脏疾病,包括慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)、肝硬化和肝癌等。全世界慢性HBV感染人数约3.6亿,每年因HBV感染相关肝病死亡的患者达100万人。HBV感染是全球性的公共卫生问题。机体的免疫系统在慢性HBV感染的病程和转归中发挥重要作用,HBV感染的慢性化与天然免疫和适应性免疫应答的抑制密切相关。目前证实,适应性免疫应答是有效控制HBV感染所必需的,HBV特异性T淋巴细胞缺乏或功能耗竭是导致HBV感染慢性化的重要因素。慢性乙型肝炎中HBV特异性T淋巴细胞应答反应显著减弱,呈窄谱、微弱、寡克隆应答,同时抑制分子表达增加,如PD-1、CD244、CTLA-4,导致HBV特异性T淋巴细胞功能耗竭,无法有效清除病毒。相比较而言,目前对于慢性HBV感染相关天然免疫应答机制的理解尚显不足。对急性HBV感染患者和黑猩猩模型的有关研究提出,HBV感染早期未能引起明显的天然免疫应答,不能诱导Ⅰ型干扰素和促炎因子的产生。然而,近年体外研究提示肝细胞内天然免疫通路可感知HBV感染并限制其播散,如嵌合小鼠模型中人肝细胞感染HBV后可检测到IFN-α基因的活化。越来越多的证据显示,HBV并非是完全“隐形”的病毒,宿主天然免疫系统可识别HBV感染,但HBV可通过多种策略抑制天然免疫应答。Toll样受体(Toll-like receptor, TLR)是一类重要的天然免疫应答分子,参与识别多种病原相关分子模式(Pathogen-associated molecular pattern, PAMP),可针对入侵的病原体启动天然免疫应答。TLR信号通路活化后,可诱导产生一系列的抗病毒因子和(或)促炎因子,如Ⅰ型干扰素(IFN-α/β)、TNF-α和IL-6等,在抗病毒免疫反应中起重要作用。TLR2是TLR家族中识别病原微生物及其产物种类最多,表达范围相对最广的分子。TLR2也参与抗HBV感染的免疫应答。Thompson等研究发现TLR2配体可激活肝癌细胞株HepG2和Huh7胞内TLR2信号通路,抑制HBV复制和核壳体形成。本课题组前期研究也发现TLR2配体可通过激活胞内MAPK/ERK和PI3K/Akt通路,抑制HepG2.2.15细胞和土拨鼠原代肝癌细胞中HBV或WHV(土拨鼠肝炎病毒,Woodchuck Hepatitis Virus)的复制和基因表达。然而,目前部分研究提示HBV可抑制TLR2表达及其介导的天然免疫应答。Visvanathan等发现在HBeAg阳性CHB患者外周血CD14+单核细胞、肝细胞和枯否细胞上TLR2表达要显著低于健康人。我们的前期在慢性WHV感染的土拨鼠模型中研究发现,外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell, PBMC)和肝组织上TLR2-mRNA的表达要显著低于未感染组；慢性WHV感染土拨鼠的PBMC细胞经过夜培养后,TLR2的表达可恢复至正常水平,提示血清中病毒相关产物可抑制TLR2表达。急性WHV感染或者慢性WHV感染抗病毒治疗过程中,PBMC上TLR2的表达与血清中WHVDNA滴度呈负相关。HBV与TLR2介导的天然免疫应答间存在相互影响,这提示恢复TLR2功能有可能成为新的治疗选择。TLR7主要表达于浆样树突状细胞(Plasmacytoid dentritic cell, pDC)、B细胞和单核／巨噬细胞的胞内体,可识别病毒单链RNA。TLR7可通过MyD88依赖途径,活化NF-κB和干扰素调节因子(Interferon regulation factor, IRF),产生I型干扰素、促炎因子和趋化因子等。此外,TLR7配体刺激还可诱导自然杀伤细胞(Natural Killer Cell, NK)和细胞毒T淋巴细胞的活化,发挥抗病毒作用。利用小鼠模型研究发现,小鼠肝炎病毒感染(Mouse Hepatitis Virus, MHV)感染后可诱导pDC通过TLR7信号通路产生IFN-α,以早期控制MHV感染。Isogawa等发现TLR7配体可通过诱导IFN-α/β产生抑制转基因小鼠肝细胞内HBV复制。最近,在慢性WHV感染土拨鼠和慢性HBV感染黑猩猩的模型中,发现TLR7激动剂GS9620可显著抑制血清中病毒复制水平,降低WHsAg或HBsAg水平；GS9620可诱导剂量依赖性IFN-α表达,促进PBMC和肝细胞的干扰素刺激基因(interferon-stimulated gene, ISG)表达发挥抗病毒效应。TLR7激动剂在慢性HBV感染中的治疗前景令人期待。慢性HBV感染的自然史可分为4个阶段：免疫耐受(immune tolerance, IT)、免疫清除(HBeAg positive CHB, immune clearance)、非活动性携带(inactive carrier,IC)和复发期。不同阶段的免疫状态不同。尽管TLR2、TLR7介导的天然免疫可能参与HBV感染的抗病毒免疫,但目前研究多局限于体外细胞实验和动物模型中,利用临床样本开展的研究仍十分有限。TLR2、TLR7在慢性HBV感染患者不同阶段中的作用仍未阐述清楚。HBV活动性复制是肝脏疾病进展的始动因素,台湾REVEAL研究长期随访发现HBV DNA水平是肝硬化、肝癌发生的独立预测因素。非活动性携带状态时,HBeAg消失、抗-HBe阳性,伴ALT正常、HBV DNA持续低于2000IU/ml或低于检测水平,病情处于相对稳定状态,发生肝硬化、肝癌的风险显著降低。因此,目前抗病毒治疗已成为CHB患者最重要的治疗手段。HBV DNA持续抑制、HBeAg血清学转换成为CHB患者抗病毒治疗的主要目标。前期研究发现,慢性WHV感染抗病毒治疗过程中,TLR2表达与WHV病毒载量呈负相关；口服TLR7激动剂GS9620显著抑制慢性HBV感染的黑猩猩模型血清中HBV DNA复制水平。然而,TLR2、TLR7在临床CHB患者抗病毒治疗过程中可能起到的作用,以及抗病毒治疗对TLR2、TLR7表达的影响,目前尚不清楚。目的：通过横断面研究探讨慢性HBV感染不同阶段的患者PBMC上TLR2、TLR7的表达变化,同时应用前瞻性队列研究动态观察HBeAg阳性CHB患者经替比夫定(LdT)或聚乙二醇干扰素α-2a(Peg-IFN-a-2a)抗病毒治疗过程中PBMC上TLR2、TLR7的表达变化,分析TLR2、TLR7在慢性HBV感染及CHB患者抗病毒治疗中的变化规律,并通过体外实验探索TLR2、TLR7在慢性HBV感染及抗病毒治疗中的作用。方法：1.研究对象横向研究共纳入94例受试者,其中包括IT患者24例、HBeAg阳性CHB患者27例、IC患者22例,并选取21例健康人(Health control, HC)作为研究对照。诊断标准主要参考中国慢性乙型肝炎防治指南2010年更新版。纳入患者来源于南方医院肝病中心和广州第八人民医院门诊患者；健康志愿者来源于南方医科大学在校大学生。纳入标准如下所述。①IT患者：至少1年连续3次或以上随访中HBsAg阳性、HBeAg阳性,且血清ALT水平正常(≤1ULN)；②IC患者：间隔至少6个月的两次随访中,HBsAg阳性、HBeAg阴性、HBeAb阳性,血清ALT水平持续正常(≤1ULN),且HBVDNA定量<1×104 copies/ml;③HBeAg阳性CHB患者：血清HBsAg、HBeAg阳性、抗-HBe阴性,HBV DNA≥1×105 copies/ml,且近期血清ALT持续或反复升高(>1 ULN)；④健康志愿者：血清HBsAg、HBeAg、 anti-HBe均阴性,且血清ALT水平正常(≤1ULN),无其他严重疾患。纵向研究纳入的对象来源于来源于两项多中心的临床试验：(1)替比夫定优化治疗的临床试验(EFFORT, NCT00962533),(2)聚乙二醇干扰素α-2a应答指导优化治疗的临床试验(EXCEL, NCT01086085)。纳入标准：①年龄介于18岁至65岁间。②筛选访视并且至少六个月前的血清HBsAg均为阳性。③筛选访视时血清HBeAg阳性并且抗HBe阴性。④筛选访视时在中心实验室测定血清HBV DNA≥1 ×105 copies/ml.⑤筛选访视时ALT≥2×ULN并且<10×ULN(排除药物或饮酒等非HBV原因导致ALT升高)。并非所有临床试验患者均参与本研究。EFFORT研究中,我们纳入本中心随机入组的41例LdT单药治疗52周的患者,临床试验其他对照组和加药优化治疗组未纳入。所有研究对象均给予LdT单药治疗52周以上,于治疗基线、12周、24周以及52周采集1ml血清用于细胞因子检测,同时留取20m1肝素抗凝血用于分离PBMC。根据治疗结束(52周或48周)时是否发生HBeAg血清学转换、血清HBV DNA定量<300copies/ml以及ALT复常,将研究对象分为完全应答组(Complete Response, CR)和不完全应答组(Non-Complete Response, NCR)。完全应答组：治疗结束时ALT复常,血清HBV DNA定量<300 copies/ml并发生HBeAg血清学转换；不完全应答组：治疗结束时ALT复常,血清HBV DNA定量仍>300 copies/ml或未发生HBeAg血清学转换。EXCEL研究中,我们根据配对原则纳入CR、NCR组患者各5例,所有患者均为Peg-IFN-a-2a单药治疗48周,临床试验的其他对照组和治疗组未纳入。所有研究对象于治疗基线、4周、12周、24周以及48周采集lml血清用于细胞因子检测,同时留取20m1肝素抗凝血用于分离PBMC。血清和PBMC分别保存于-80℃和液氮中。在体外实验中,我们另外随机纳入10例HBeAg阳性CHB患者、5例IT患者和10例健康志愿者(HC)。诊断标准和标本采集同前述。所有研究符合赫尔辛基宣言,并经南方医院伦理委员会审核同意,所有研究对象签署知情同意书。2.血清生化学和病毒学检测生化学检测：采用Olympus AU5400全自动生化分析仪。病毒学检测：HBVDNA定量检测采用Cobas荧光定量PCR法分析,HBV血清标志物(HBsAg、 HBsAb、HBeAg、HBeAb和HBcAb)采用微粒子化学发光法检测。3. PBMC分离和磁珠分选PBMC采用Ficoll-Hypaque梯度离心法进行分离,用含10%二甲亚砜的胎牛血清冻存至液氮。横断面和体外研究采用新鲜分离PBMC标本,纵向队列研究采用冻存后复苏PBMC标本。新鲜分离HC组(n=8)和CHB组(n=8)患者PBMC,用于磁珠分选CD14+单核细胞和T淋巴细胞。利用CD14阳选磁珠从新鲜分离PBMC中获得CD14+单核细胞,将未结合的磁珠细胞利用Pan T阴选磁珠分离T淋巴细胞。利用7-AAD-PerCP、anti-CD3-PE、anti-CD14-APC小鼠抗人单克隆抗体流式标记CD14+单核细胞、T淋巴细胞,纯度均>95%。余下的细胞认定为非单核非T细胞。4.实时定量RT-PCR取2×106个新鲜分离或冻存后复苏PBMC,利用RNeasy Mini kit (Macherey-Nagel)抽取细胞总RNA。取500ng总RNA利用QuantiTect Reverse Transcription Kit (Qiagen)逆转录成cDNA。应用商品化引物QuantiTect Primer Assays (Qiagen)定量检测目的靶基因。利用QuantiTect SYBR Green RT-PCR Kit (Qiagen)在LighterCycler480仪器按操作说明通过两步法进行RT-PCR检测。以β-actin为内参,计算目的靶基因的相对表达量。5. PBMC体外刺激新鲜分离PBMC用R10培养基(含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100μg/ml链霉素和1 mmol/L谷氨酰胺的RPMI 1640培养基)重悬,按5×106个/ml密度接种于24孔板,分别加入TLR2配体(Pam3CSK4,终浓度5μg/ml)、TLR7配体(Imiquimod,终浓度5μg/ml)、TLR8配体(ssRNA40/LyoVecTM,终浓度0.5μg/ml)刺激,同时设立无关蛋白(BSA,终浓度5ug/ml)作为对照,37℃、5%C02培养48h后,收集上清,以备用于处理HepG2.2.15细胞。其中部分Pam3CSK4、Imiquimod或ssRNA40/LyoVecTM刺激孔和对照孔(HC组、CHB组各5例)在培养最后5小时加入布雷菲德菌素A(BFA,终浓度1 ug/ml),以备流式标记及检测T淋巴细胞和NK细胞亚群的胞内因子分泌；部分Pam3CSK4刺激孔、对照孔(HC组、IT组各5例)在培养3h后,收集2×106个PBMC,离心沉淀后,加入350μl RA1液和3.5μl的p-巯基乙醇,冻存于-80℃冰箱,备抽提RNA以检测TNF-α-mRNA表达。6. HepG2.2.15细胞培养和HBV复制分析HepG2.2.15细胞用1640培养基(含100%胎牛血清、500μg/ml G418、0.1mM非必需氨基酸、2mM谷氨酞胺)培养,37℃、5%C02培养,隔天传代。转染前一天,将HepG2.2.15细胞接种6孔板,7.5×105／孔。接种16-20h后,细胞融合密度达90%以上。将上述对照组、TLR2、TLR7和TLR8配体刺激后的上清液按不同浓度比例(上清／培养基=0、1/5、1/10、1/20、1/40)加入1640培养基中；并在TLR7配体刺激PBMC后的上清液中加入人anti-IFN-α、anti-IFN-β、anti-IFN-γ或anti-TNF-α(分别取3个浓度梯度：0.1μg/ml, 1μg/ml和10μg/ml)来中和相应的细胞因子,观察TLR7配体刺激PBMC通过何种细胞因子产生抗病毒效应。取出6孔板,吸弃去旧培养基,加入上述含上清液的培养基进行更换。继续培养4天后,从HepG2.2.15细胞中提取HBV核心颗粒,Southern blot检测HepG2.2.15细胞中HBV复制,RT-PCR检测HepG2.2.15细胞内HBV-DNA定量。7.流式细胞分析利用胞内因子染色(Intracellular cytokine staining, ICS)检测T淋巴细胞、NK细胞胞内TNF-α、IFN-γ或CD107a分泌。处理过的PBMC在培养最后5小时加入BFA(终浓度1μg/ml),阻断胞内细胞因子分泌；NK细胞检测同时加入anti-CD107a-PE; PBMC收集后用PBS洗涤,NK细胞检测加入Live/Dead-APC-Cy7、anti-CD3-PerCP-Cy5.5和anti-CD56-FITC,T淋巴细胞检测加入Live/Dead-APC-Cy7、anti-CD4-FITC和anti-CD8-APC小鼠抗人单克隆抗体,4℃避光孵育30 min；再次洗涤离心,加入Cytofix/Cytoperm Solution(BD Bioscience)予细胞固定和破膜,4℃避光孵育20min；加入Perm/Wash液(BD Bioscience)洗涤,NK细胞胞内因子染色加入anti-IFN-γ-APC、anti-TNF-α-PerCy7或相应同型对照抗体,T淋巴细胞胞内因子染色检测加入anti-IFN-γ-PE、 anti-TNF-α-PerCy7或相应同型对照抗体,室温避光孵育30min；利用BDFACSDiva (BD Bioscience, San Jose, CA)仪器进行流式检测,应用FlowJo软件(Tree Star Inc, Ashland, OR)分析流式检测结果。8.统计分析所有数据采用SPSS 16.0和GraphPad Prism 5.0进行处理及构图。计数资料采用列联表卡方检验；两组间计量资料符合正态分布时采用两独立样本t检验,不满足正态分布时采用两独立样本秩和检验Mann-Whitney U test;配对样本不同处理的计量资料采用Wilcoxon符号秩检验。多组间计量资料符合正态分布时采用单因素方差分析,不满足正态分布时采用多个独立样本非参数Kruskal-WallisH检验,多重比较采用两独立样本秩和检验；纵向研究中样本重复测量数据比较采用一般线性模型重复测量分析和多元方差分析,保守Greenhouse-Geisser法校正得到的交互效应的P值用于单变量分析,各个时间点上的两组间比较采用多元方差分析,不同时间点的多重比较采用LSD-t检验。建立受试者工作特征(ROC)曲线的用于预测完全应答。所有统计分析基于双侧假设检验,以α=0.05为检验水准,P<0.05具统计学意义；多组间计量资料采用两独立样本秩和检验进行多重比较时,取检验水平为α/κ(a=0.05,κ为比较次数)。结果1.慢性HBV感染不同状态下PBMC TLR2、TLR7-mRNA表达水平的比较慢性HBV感染患者PBMC TLR2-mRNA的表达较健康人显著下调(P<0.001); TLR7-mRNA的表达呈相似趋势,但差异无统计学意义(P=0.141)。进一步分析发现,IT组和IC组患者PBMC TLR2、TLR7-mRNA水平显著低于HC组(TLR2:HC vs IT, P<0.001, HC vs IC, P<0.001; TLR7:HC vs IT, P=0.028, HC vs IC, P=0.001);而CHB处于肝炎活动状态时PBMC上TLR2、TLR7表达显著上调(TLR2:CHB vs IT, P=0.002, CHB vs IC, P=0.0117; TLR7:CHB vs IT, P=0.003, CHB vs IC, P<0.001)。HC组患者TLR2-mRNA表达略高于CHB组,但差异无显著意义(P=-0.088)；HC组与CHB组患者TLR7-mRNA表达水平无明显差异(P=0.135)。IC组患者TLR2、TLR7-mRNA表达与IT间无显著性差异(P=0.362,P=0.214)。这些结果提示：慢性非活动性HBV感染可抑制PBMC上TLR2、TLR7-mRNA的表达,但CHB患者处于肝炎活动时可上调TLR2、 TLR7-mRNA的表达。2.CHB患者CD14+单核细胞上TLR2、TLR7的表达仍受抑制如上所述,CHB患者PBMC TLR2、TLR7-mRNA的表达较IT、IC患者显著上调,与HC组间无显著性差异。为了评估CHB患者PBMC上不同细胞亚群上TLR2、TLR7表达是否均可得到恢复,我们通过磁珠分选将PBMC分为3个亚群：CD14+单核细胞、T淋巴细胞和非单核非T细胞,比较HC组和CHB组患者各个细胞亚群间TLR2、TLR7-mRNA的表达水平。不论HC组或CHB组,TLR2、TLR7主要表达于CD14+单核细胞,高于T淋巴细胞、非单核非T细胞上的表达。CHB组患者CD14+单核细胞TLR2、TLR7-mRNA的表达均低于HC组患者(P=0.0499,P=0.021)；而CHB组和HC组间非单核非T细胞TLR2、 TLR7-mRNA的表达并无显著性差异(P=0.161,P=0.442)。HC组和CHB患者T淋巴细胞TLR2的表达亦无显著性差异(P=0.442)；TLR7几乎不表达于T淋巴细胞上,未进一步分析比较。我们发现,尽管CHB患者PBMC TLR2、 TLR7-mRNA的的表达得到一定程度的恢复,但CD14+单核细胞亚群TLR2、 TLR7仍明显受抑,提示其所介导的天然免疫应答并未完全恢复。3.CHB患者治疗基线PBMC高表达TLR2.TLR7与LdT抗病毒治疗应答反应存在相关性研究纳入EFFORT研究中41例HBeAg阳性CHB患者,其中CR组18例、NCR组23例。CR组和NCR组间无论年龄、性别、HBV基因型、ALT、HBV-DNA、 HBsAg、HBeAg和HBcAb均无显著性差异(表3-1)。比较治疗基线时患者PBMC上TLR2、TLR7-mRNA的表达水平,发现CR组TLR2、TLR7-mRNA的表达显著高于NCR组(P=0.029,P=0.038)。建立ROC曲线显示治疗基线时患者PBMC上TLR2、TLR7-mRNA的表达水平均可预测LdT抗病毒治疗52周产生完全应答(AUC:0.70, P=0.029; AUC:0.69, P=0.038)。这些结果提示,CHB患者治疗基线时PBMC高表达TLR2、TLR7对LdT抗病毒治疗的应答效果更佳。我们另外纳入EXCEL研究中10例HBeAg阳性CHB患者,其中CR组5例、NCR组5例,比较两组患者治疗基线时PBMCTLR2、TLR7-mRNA的表达水平。与LdT治疗不同,Peg-IFN-a-2a治疗基线两组间TLR2、TLR7的表达并无显著性差异(P=0.690,P=0.548)。4.LdT和Peg-IFN-a-2a抗病毒治疗过程CHB患者PBMC TLR2、TLR7-mRNA的动态变化研究纳入的EFFORT队列患者中,我们观察了20例CHB患者TLR2、TLR7-mRNA的表达动态变化,其中CR组和NCR组各10例。总的趋势上,LdT抗病毒治疗过程中CHB患者TLR2、TLR7-mRNA的动态变化呈波浪状起伏。从治疗基线至治疗12周时,CHB患者PBMC上TLR2、TLR7的表达呈平稳下降趋势；然而,在治疗12周至24周期间, ALT已基本正常、HBV-DNA持续下降,此时TLR2、TLR7表达出现反弹；最后,治疗24周至52周期间,TLR2、 TLR7表达变化差异不显著。样本重复测量分析显示CHB患者PBMC上TLR7的表达在4个时间点的动态变化整体检验有显著性统计学意义(P=0.034),而TLR2的纵向动态变化整体检验差异并无显著性意义(P=0.564,ε系数校正)。组间变异度分析发现,各个时间点上CR组和NCR组患者PBMC上TLR2、TLR7表达的差异并无显著性意义(TLR2:F=0.228, P=0.639; TLR7:F=3.156, P=0.093)。同时,我们纳入EXCEL研究中10例HBeAg阳性CHB患者(CR组,n=5；NCR组,n=5),动态观察Peg-IFN-α-2a抗病毒治疗过程中PBMC上TLR2、TLR7的表达变化。样本重复测量分析组间变异度发现,各个时间点上CR组和NCR组患者PBMC上TLR2、TLR7表达的差异并无显著性意义(TLR2:F=0.03, P=0.866; TLR7:F=1.557, P=0.247)。所纳入的10例CHB患者TLR2表达略呈平稳下降趋势,但整体检验无显著性差异(P=0.123)。然而,TLR7的表达在Peg-IFN-α-2a治疗过程中显示出与LdT治疗过程中完全不同的动态变化模式。我们发现从Peg-IFN-α-2a治疗基线到治疗12周期间,无论CR组或NCR组,TLR7的表达均呈现平稳上升趋势。然而,在随后的治疗12周到48周期间,两组间TLR7的表达趋势截然不同,CR组患者的TLR7表达略有平缓上升,但NCR组患者的TLR7表达呈下降趋势。CR组患者PBMC上TLR7-mRNA的表达在5个时间点的动态变化整体检验有显著性差异(P=0.004),治疗4周、12周、24周和48周时TLR7-mRNA的表达均显著高于治疗基线时TLR7-mRNA的水平(P=0.024, P=0.002, P=0.018, P=0.005)。尽管NCR组患者治疗基线至12周时TLR7也呈现上升趋势,但NCR组TLR7的动态变化从整体检验上尚未达到统计学意义(P=-0.067)。单独将治疗48周时CR组和NCR组患者TLR7的表达进行比较,发现48周时CR组患者TLR7表达高于NCR组,但由于例数偏少,临近尚未达统计学意义(P=0.056)。5.TLR7配体刺激PBMC可通过分泌IFN-a/y抑制HBV复制利用TLR2配体(Pam3CSK4)、TLR7配体(Imiquimod)、TLR8配体(ssRNA40/LyoVecTM)刺激HC组或CHB组患者PBMC,培养48h后收集上清,设立无关抗原BSA刺激为对照组。用不同TLR配体刺激后或对照组的上清液处理HepG2.2.15细胞,观察其对细胞内HBV复制的影响。我们发现,TLR7、TLR8配体刺激PBMC后的上清液均可抑制HBV复制,使得HepG2.2.15细胞中HBV-DNA定量下降、细胞内HBV复制中间体产生减少,这种抑制效应在HC组和CHB组中相似,并且随着上清液浓度递增而逐渐增强。然而,TLR2信号通路诱导活化后并不能明显抑制HBV复制。通过在TLR7配体刺激PBMC后的上清液中加入人anti-IFN-α、anti-IFN-β、 anti-IFN-γ和anti-TNF-α来中和相应的细胞因子,观察TLR7配体刺激PBMC所产生的抗病毒效应是否可以逆转。中和IFN-α、IFN-γ使得TLR7介导的抑制HBV作用可得到一定程度的逆转,这种效应呈浓度依赖性；而anti-IFN-β、anti-TNF-α预处理并不能消减TLR7介导的抗病毒效应。这些结果提示,TLR7配体刺激PBMC可诱导产生IFN-α、IFN-γ参与抑制HBV复制。6.TLR2配体刺激可诱导IT患者PBMC产生TNF-α尽管TLR2配体刺激PBMC并不能抑制HBV复制,但TLR2信号通路可诱导产生TNF-α、IL-6等促炎细胞因子,有利于控制HBV。研究发现,IT患者PBMC上TNF-α的基础水平较HC组低(P=-0.032)；TLR2配体刺激HC和IT患者PBMC后均可显著诱导TNF-α产生(P=0.043,P=0.043)；IT患者PBMC并不存在TLR2应答耐受或不应答,但TLR2配体刺激后诱导产生的TNF-α表达仍较HC低下(P=0.056)。TLR2表达的恢复可能诱导产生更多TNF-α,有利于控制病毒。7. TLB2、TLR7配体刺激PBMC对T淋巴细胞、NK细胞功能的影响TLR可通过刺激DC产生I型IFN、IL-12等,促进CD8+T淋巴细胞活化,启动适应性免疫应答；还诱导NK细胞活化,增强NK细胞分泌IFN-γ、细胞毒功能。我们利用TLR2、TLR7、TLR8配体刺激PBMC,观察能否诱导或增强NK细胞、T淋巴细胞功能。然而,研究发现,除了TLR8配体刺激可增强HC、CHB患者NK细胞分泌IFN-γ外(P=0.043,P=0.043),我们并没有发现TLR2、 TLR7配体能诱导或增强T淋巴细胞、NK细胞的功能；TLR8配体也并不能诱异T淋巴细胞功能、NK细胞的其它功能发生明显变化。这可能还需要设计更严谨的实验来探索。结论：1.慢性非活动性HBV感染可抑制PBMC上TLR2、TLR7-mRNA的表达；CHB肝炎活动可上调PBMC上TLR2、LR7-mRNA的表达,但CHB患者CD14+单核细胞亚群上TLR2、TLR7-mRNA的表达仍受抑制。2.纵向队列研究发现,治疗基线CHB患者PBMC上高表达TLR2、 TLR7-mRNA有利于LdT抗病毒治疗52周时发生完全应答,但治疗基线TLR2、 TLR7-mRNA水平并不能预测Peg-IFN-α-2a的治疗应答；Peg-IFN-α-2a治疗可诱导CHB患者PBMC上TLR7-mRNA表达上调,治疗48周结束时完全应答组患者TLR7-mRNA水平高于非完全应答组,TLR7介导的免疫应答可能参与IFN-α的抗病毒效应。3.体外研究发现,TLR7配体刺激CHB患者PBMC可通过IFN-α、IFN-γ途径产生抗病毒效应；TLR2配体刺激可诱导慢性HBV感染患者产生TNF-α。这些途径提示CHB患者PBMC上TLR2、TLR7表达的恢复有利于控制HBV。