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目的:程序性坏死是一种以细胞器膨胀以及细胞膜破裂为特征的细胞死亡形式,这种细胞死亡形式是以坏死性信号复合物-坏死小体介导的。已知,RIP1K、RIP3K和MLKL是程序性坏死中坏死小体的核心组分。有证据表明,在细胞程序性坏死时,受体相互作用蛋白激酶3(receptor-inter,acting protein 3 kinase,RIP3K)和混合谱系激酶结构域蛋白(mixed lineage kinase domain-like protein,MLKL)都会发生核定位现象。但是,RIP3K及MLKL核定位的分子机制目前仍需进一步的研究。因此,本课题研究了细胞程序性坏死过程中RIP3K及MLKL核定位的分子机制,并阐明这两种不同的程序性坏死关键蛋白核定位之间的关系。方法:在本研究中,以终浓度为10 ng/ml的肿瘤坏死因子α(tumour necrosis factorα,TNFα)+20mM的Z-VAD-FMK(zVAD)共同刺激L929细胞构建程序性坏死的体外模型。分离细胞质、细胞核及核膜并采用western blotting和细胞免疫荧光法观察TNFα+zVAD刺激诱导L929细胞时程序性坏死相关蛋白(RIP1K、RIP3K和MLKL)、凋亡诱导因子(apoptosis-inducing factor,AIF)和巨噬细胞迁移抑制因子(macrophage migration inhibitory factor,MIF)的胞内分布情况变化;同时采用免疫共沉淀法检测RIP1K、RIP3K、MLKL、AIF和MIF之间的相互结合。通过CRISPR-Cas9系统构建了 AIF敲除(AIF-KO)的L929稳定细胞株和AIF核定位信号序列(nuclear location sequence,NLS)敲除(AIF-NLS-KO)的L929稳定细胞株后,利用细胞ATP水平检测和碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)染色实验观察AIF-KO和AIF-NLS-KO对TNFα+zVAD诱导的L929细胞坏死的影响;同时,利用western blotting观察AIF-KO和AIF-LNS-KO对TNFα+zVAD刺激的L929细胞的RIP3K与MLKL核定位的影响。最后,利用药理学干预的手段观察RIP3K信号与MLKL信号之间的关系,以及RIP1K对RIP3K和MLKL核定位的影响。在体内,建立大鼠脑中动脉阻塞再灌注(middle cerebral artery occlusion reperfusion,MCAO/R)模型,以此模拟人脑缺血损伤的病理发展过程。利用PI染色实验和western blotting法,观察缺血性脑中风脑组织坏死情况,以及程序性坏死相关蛋白表达水平及活化水平的变化。最后,利用western blotting和免疫共沉淀法验证缺血性脑中风是否也可使脑组织细胞发生和TNFα+zVAD刺激诱导细胞程序性坏死时同样的胞内事件。结果:①利用细胞质、细胞核与核膜分离结合western blotting的方法和细胞免疫荧光检测,发现TNFα+zVAD刺激使胞浆内RIP1K、RIP3K、MLKL、tAIF和MIF表达升高,并上调了 RIP1K、RIP3K和MLKL的磷酸化水平;TNFα+zVAD刺激也促进RIP3K、MLKL、tAIF和MIF的入核,但并没有检测到RIP1K的入核。Western blotting结果也显示,MLKL存在核膜定位现象,TNFα+zVAD刺激使其核膜定位增加。②免疫共沉淀的实验结果显示,TNFα+zVAD刺激使胞浆内形成复合物RIP3K-tAIF-MIF并进入细胞核,且MLKL不是该复合物的组分;免疫荧光共定位实验的结果与免疫共沉淀结果一致。以上结果提示:程序性坏死会导致核定位复合物RIP3K-tAIF-MIF形成,且该复合物独立于MLKL存在。③利用CRISPR-Cas9系统,构建了 AIF-KO和AIF-NLS-KO的L929稳定细胞株。细胞ATP水平测量和PI染色结果显示,AIF-KO和AIF-NLS-KO显著抑制了TNFα+zVAD诱导的细胞程序性坏死。Western blotting结果发现,AIF-KO和AIF-NLS-KO 阻断了复合物 RIP3K-tAIF-MIF 入核。以上结果提示:RIP3K-tAIF-MIF的入核需要以AIF作为载体,而且AIF的这种载体功能是依赖于核定位序列的。④NSA(necrosulfonamide,一种MLKL活性特异性抑制剂)处理阻断了细胞mAIF的剪切,降低了细胞浆与细胞核内tAIF的蛋白水平;GSK’872(RIP3K激酶活性特异性抑制剂)处理也能够阻断了 mAIF的剪切,降低了细胞浆与细胞核内tAIF的蛋白水平,同时也阻断了 MLKL的核膜定位。利用基因敲除的手段和免疫共沉淀方法,发现AIF-KO及AIF-NLS-KO对RIP3K-MLKL在胞浆的相互作用无影响;AIF-NLS-KO对MLKL的核膜定位无影响。以上结果提示:RIP3K-tAIF-MIF复合物形成及其入核是一条不同于MLKL信号的细胞坏死通路;虽然,mAIF剪切及tAIF生成受RIP3K和MLKL调节。⑤利用nec-1(necrostatin-1,一种RIP1K激酶活性特异性抑制剂)抑制了TNFα+zVAD诱导的RIP1K的磷酸化,并通过western blotting和免疫共沉淀法观察了其下游坏死信号的变化情况。结果显示,nec-1处理阻断TNFα+zVAD刺激诱导的RIP3K的入核、mAIF剪切及RIP3K-tAIF-MIF复合物的形成;同时,降低了 MLKL的核膜定位。说明,RIP3K-tAIF-MIF核定位复合物形成与MLKL核膜定位都是RIP1K激酶活性依赖性的。⑥在体内,我们建立了大鼠脑中动脉阻塞再灌注(middle cerebral artery occlusion and reperfusion,MCAO/R)模型,并利用PI染色和western blotting检测缺血损伤区细胞坏死和坏死相关蛋白(RIP1K、RIP3K、MLKL、AIF和MIF)表达情况。结果显示,缺血性再灌注可使da脑皮层缺血区发生坏死,并上调了缺血损伤区程序性坏死相关蛋白的表达水平及活化程度。进一步检测发现,大脑皮层缺血损伤区有MLKL核膜定位和程序性坏死复合物RIP3K-tAIF-MIF形成。结论:①细胞程序性坏死过程中有核定位复合物RIP3K-tAIF-MIF的形成,该复合物独立于MLKL信号存在;且该复合物的入核依赖于AIF的核定位信号序列。②活化后的RIP3K和MLKL既能够核膜定位,也参与调节了线粒体膜上AIF剪切为tAIF的过程。③RIP3K-tAIF-MIF核定位复合物形成与MLKL核膜定位都是RIP1K激酶活性依赖性的。④程序性坏死参与了缺血性脑中风组织损伤的病理过程;脑缺血再灌注损伤既可使缺血损伤区线粒体膜上的mAIF剪切为功能形式tAIF,也能诱导MLKL活化并使其定位于细胞核膜。⑤大脑皮层缺血损伤区有程序性坏死复合物RIP3K-tAIF-MIF形成。