家蚕丝腺是唯一能够高效特异地合成丝蛋白的器官，其中后部丝腺合成丝素蛋白，中部丝腺合成丝胶蛋白，丝素和丝胶蛋白按一定比例组合形成蚕丝蛋白。在幼虫眠期和变态期，家蚕只合成少量或不合成丝蛋白，进入五龄盛食期，丝素丝胶基因的转录水平大大提高，丝蛋白被大量合成。目前科学家已经在家蚕丝腺中发现了大量的转录因子广泛的参与丝腺器官的发育、丝蛋白基因的转录以及丝腺细胞的凋亡等生命过程，这些转录因子中参与调控丝蛋白基因表达的多属于HOX和FOX家族，而bHLH家族的转录因子鲜见报道。家蚕基因组数据和基因芯片数据的公布，为我们研究家蚕丝腺特异转录调控因子提供了信息平台。通过基因芯片数据的检索，我们发现了在家蚕丝腺特异表达的并且含有bHLH结构域的转录因子一Bmdimm和Bmsage，bHLH(螺旋-环-螺旋)结构域能与DNA特异结合从而调控基因的表达，其中Bmdimm在后部丝腺特异表达，Bmsage在中部和后部丝腺特异表达。我们推测，bHLH转录因子很有可能也参与了家蚕丝蛋白基因的转录调控。因此本研究对其进行生物信息学分析、克隆、组织原位杂交和体外表达，以探讨它在丝蛋白基因的转录调控中扮演的角色，研究结果如下： 1.家蚕Bmdimm和Bmsage基因的生物信息学分析 Bmdimm和Bmsage基因全长分别为3649bp和2435bp，都含有4个外显子和3个内含子，其中Bmdimm位于家蚕第17号染色体上，而Bmsage与家蚕丝腺一个重要的功能基因fib-H位于同一条染色体-25号染色体上。我们将预测的Bmdimm和Bmsage蛋白质序列在smart网站上进行结构预测证实了这两个基因属于bHLH家族转录因子。 2.家蚕Bmdimm和Bmsage基因时空表达特性及组织原位杂交 家蚕五龄三天的芯片数据分析及mRNA水平表达谱分析结果显示，Bmdimm只在家蚕的后部丝腺特异表达，而Bmsage基因在家蚕中部丝腺和后部丝腺中都有表达，但是在其他组织中这两个基因的表达量很低或者根本不表达。从家蚕四龄期剑五龄期，Bmdimm和Bmsage基因的表达量随着家蚕丝蛋白基因转录水平的提高呈上升趋势，而丝蛋白基因转录停止后Bmdimm和Bmsage基因的表达量也急剧下降Bmdimm基因只在后部丝腺表达，但是在该基因不同时期的表达谱中我们发现它在四龄眠期的前中丝也山现了表达，Bmdimm基因的这一表达特性需要我们在今后的研究中深入探讨。Bmsage基因在未受精卵中的表达程度并不高，胚胎发育一天的表达量较高，从胚胎发育第三天开始到蚕卵孵化成蚁蚕Bmsage的表达量呈逐渐上升趋势家蚕五龄三天的组织表达谱显示，而Bmdimm在家蚕胚胎期不表达。 为了直观的观察Bmdimm和Bmsage基因在丝腺组织中的表达部位，我们合成了Bmdimm和Bmsage的cDNA探针，采用原位杂交的方法在家蚕丝腺器官对它们进行组织定位，结果显示在家蚕后部丝腺检测到了Bmdimm和Bmsage的杂交信号，在中部丝腺检测到了Bmsage的杂交信号，这一结果与Bmdimm和Bmsage基因在mRNA水平上的表达特性一致。Bmdimm和Bmsage的杂交信号都来自于丝腺细胞的细胞核，这与转录因子在细胞核中发挥作用的特性相吻合。 3.家蚕Bmdimm和Bmsage基因的克隆及蛋白表达 根据Bmdimm和Bmsage基因的CDS序列设计引物，对基因进行体外克隆，通过测序验证克隆得到的核苷酸序列与预测相一致，没有发生碱基变化。然后将Bmdimm和Bmsage基因编码区亚克隆到pET50b(+)表达载体，转化到BL21表达菌株，以IPTG诱导重组质粒表达目的蛋白。通过优化诱导条件(30℃，IPTG终浓度为1mM、培养3h)我们得到了可溶性蛋白，然后采用亲和层析的方法对可溶蛋白进行了纯化。