慢性乙型病毒性肝炎(Chronic Hepatitis B，CHB)的发病机制一直是传染病领域研究的重点、难点。至今，乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus，HBV)感染慢性化以及其持续感染的机制尚未阐明。在当前慢性乙型肝炎治疗缺乏有效措施的情形下，研究弄清HBV感染慢性化及持续感染的发生机制尤显重要、紧迫。很多研究认为，HBV持续感染与体内树突状细胞(Dendritic cells，DCs)的功能下调密切相关，但对DCs功能下调的发生机制尚无一致认识。由于在CHB患者外周血中分离的DCs是在HBV感染后已经呈现持续感染状态中的细胞，我们认为此时机体的免疫状态应以适应性免疫(adaptive immune)为主，而HBV感染慢性化应是天然免疫(innate immune)和适应性免疫共同作用的结果，因此，此时DCs的功能下调，可以解释HBV持续感染时机体的免疫状态，但这尚不能解释HBV感染慢性化的过程。本课题中，我们以DCs的成熟障碍(Dysmaturation)的发生机制为研究目的，联系天然免疫和适应性免疫中与DCs的生物学功能密切相关的关键因素：患者外周血HBV DNA载量和DCs上表达的Toll样受体(Toll-like receptors，TLRs)，结合CHB的临床特征，开展研究。第一部分不同HBV DNA载量的慢性乙型病毒性肝炎患者外周血树突状细胞的表型、功能变化目的研究观察不同HBV DNA载量的慢性乙型肝炎患者外周血树突状细胞(Dendritic Cells，DCs)表型、功能变化，探讨HBV在DCs成熟障碍中的作用机制。方法筛选慢性乙型肝炎患者28例，入选时予PCR法测定外周血HBV DNA载量，经肝穿刺明确肝组织病理状态。入选病例符合HBV DNA载量＞10~5copies／ml；除外其他肝脏疾病及自身免疫性疾病两个条件。入选后，所有病例予以核苷类似物抗病毒治疗24周，再次测定外周血HBV DNA及肝穿刺。依据治疗前后外周血HBV DNA载量分为两组：高载量组(CHB-H组)28例(HBVDNA＞10~5copies／ml)和低载量组(CHB-L组)25例(HBV DNA＜10~4copies／ml)。从患者外周血分离单核细胞，体外诱导培养DCs。用流式细胞仪测定DCs表型；MTF法测定DCs对同种异体淋巴细胞的刺激增殖作用；ELISA法测定DCs分泌IL-12、IL-10等方法进行研究。同时以10例健康人作对照。结果1 CHB-H组慢性乙型肝炎患者肝组织炎症程度较CHB-L组为重，两者有显著性差异(P＜0.05)，但两组间肝纤维化程度无显著性差异，P＞0.05。2 DCs在体外经细胞因子的刺激可明显增殖，但慢性乙型肝炎患者DCs的扩增数量、速度低于正常人(P＜0.02)。3 DCs表面标记：正常人的HLA-DR、CD86(B7-1)、CD80(B7-2)和CD83表达阳性率均大于80％，而两组CHB患者HLA-DR、CD86(B7-1)、CD80(B7-2)和CD83的表达率普遍降低，CHB-H组分别为43.22±8.22％、37.89±7.75％、39.24±8.56％及20.31±4.86％；CHB-L组分别为45.11±7.99％、40.37±6.52％、37.48±7.71％和22.87±5.68％。CHB患者DCs表面分子HLA-DR、CD86(B7-1)、CD80(B7-2)和CD83的表达较正常对照均显著降低(P＜0.001)，尤以CD83的降低更为显著；不同HBV DNA载量的两组CHB患者间则无显著性差异(p＞0.05)。4两组慢性乙型肝炎患者的DC在MLR中的刺激能力无显著性差异(p＞0.05)，但明显低于正常对照组(p＜0.01)。5 CHB-H组DCs、CHB-L组DCs和正常人DCs上清液中IL-10的量分别为(19.74±8.34)pg／ml、(21.36±4.88)pg／ml和(25.23±9.46)pg／ml，各组间差异无显著性；在纯DCs培养和MLR中，IL-12的量CHB-H组为(102.37±48.96)pg／ml，CHB-L组为(122.27±51.36)pg／ml则分别明显低于正常人DCs(304.55±101.52)pg／ml和(116.27±55.54)pg／ml，有显著性差异(P＜0.005)。结论1慢性乙型肝炎患者外周血HBV DNA载量与肝组织炎症程度成正相关；2慢性乙型肝炎患者外周血DCs存在成熟障碍；3慢性乙型肝炎患者外周血DCs表型缺陷、刺激T细胞功能下调；4慢性乙型肝炎患者DCs的表型变化、功能下调与外周血HBV DNA载量间无显著相关性。第二部分慢性乙型肝炎患者外周血树突状细胞上Toll样受体3的表达变化研究目的：观测分析慢性乙型肝炎患者外周血树突状细胞上Toll样受体3(Toll-like receptor 3，TLR3)的表达变化，研究慢性乙型肝炎患者外周血DCs成熟障碍的原因，探讨HBV感染慢性化与持续感染的机制。方法：筛选慢性乙型肝炎患者20例。入选时予PCR法测定外周血HBV DNA载量。入选病例符合HBV DNA载量＞10~5copies／ml除外其他肝脏疾病及自身免疫性疾病两个条件。入选后，予以核苷类似物抗病毒治疗16周，再次测定外周血HBV DNA。依据治疗前后外周血HBV DNA载量分为两组：CHB-H组20例(HBV DNA＞10~5copies／ml)和CHB-L组17例(HBV DNA＜10~4copies／ml)。从患者外周血分离获取单核细胞，体外诱导培养DCs，对未成熟期DCs(immaturative DCs，imDCs)与成熟期DC(maturative DCs，mDCs)用流式细胞仪进行表型测定；ELISA法测定DCs分泌IL-12等方法进行研究；分别对imDCs与mDCs应用流式细胞仪法和免疫印迹法(western blot)法测定TLR3的表达。同时以10例健康人作对照。结果：1 DCs在体外经细胞因子的刺激可明显增殖，但较含胎牛血清的完全培养基的培养方式，其增殖速度较慢、数量较少(P＞0.05)；2正常人组DCs于培养第5、7天CD80、CD86、HLA-DR、CD83的表达率分别为：28.31±8.79、82.35±8.67；31.17±11.23、79.61±10.08；27.61±10.28、92.79±8.48；23.46±11.53、83.76±5.47，各组间比较均有显著性差异，(P＜0.001)。CHB-H组DCs于培养第5天CD80、CD86、HLA-DR、CD83的表达率分别为：18.57±10.22、24.16±10.46、17.87±10.38、14.28±6.77；而第7天的表达率分别为：42.46±9.22、40.72±11.24、48.57±12.51、22.25±11.22，各表面分子的表达率第5天和第7天两组间的比较，均无统计学差异，P＞0.05。CHB-L组DCs于培养第5、7天CD80、CD86、HLA-DR、CD83的表达率分别为：20.13±10.43、39.48±7.63；19.16±6.45、34.58±13.44；22.24±12.37、43.73±16.87；15.39±10.44、21.68±6.38，组间比较P＞0.05。3正常人组、CHB-H组和CHB-L组imDC上TLR3的表达率分别为8.89±4.21、7.46±4.11、28.49±7.72，mDCs上TLR3的表达率分别为：正常人组5.71±4.33、CHB-H组6.68±3.17、CHB-L组6.15±3.88、。统计学分析结果：正常人imDCs上TLR3的表达率明显高于两组CHB患者，P＜0.001，有显著性差异；而两组CHB患者imDC上TLR3无显著性差异，P＞0.05。正常人组imDCs上TLR3的表达率高于其mDCs，有显著性差异，P＜0.001；而慢乙肝患者imDCs与mDCs上TLR3的表达率无显著性差异，P＞0.05。4 CHB患者DCs上TLR3的表达与其外周血HBV DNA载量无明显相关性。CHB患者mDC上TLR3的表达与imDC无显著性差异(p＞0.05)。5三组DCs的培养上清夜中IL-12的产量：正常对照组分别为：41.54±20.75、137.62±43.38；CHB-H组分别为26.22±11.20、31.84±12.35；CHB-L组分别为31.59±14.16、42.11±10.76，与正常对照相比较，两组CHB的DCs产生IL-12的水平降低(P＜0.05)。结论：1通过细胞因子组合IL-4、GM-CSF体外培养扩增的DCs为imDC，经TNF-α处理后的DCs为mDCs；2 CHB患者外周血DC上存在TLR3的表达减少；3 DCs上TLR3的表达变化可影响CHB患者DCs的表型、功能；4 CHB患者DCs上TLR3的表达变化与其外周血HBV DNA载量间无明显相关性；5 CHB患者外周血DC上存在TLR3的表达缺陷，可能为DCs成熟障碍、功能下调的重要原因。