论文部分内容阅读
目的：应用基因工程的方法构建pDON-AI-2Neo-HSV1-tk-IRES2-EGFP重组质粒,将HSV1-tk和EGFP双报告基因转染至小鼠骨髓间充质干细胞中,得到BMSCs-EGFP-tk细胞；观察其HSV1-tk基因的表达情况和对肺腺癌A549细胞体外抑制/杀伤作用,为肺癌基因治疗提供实验依据。方法：应用PCR扩增技术从质粒pHSV106(?)中扩增出HSV1-tk基因,借助pMD18-T载体构建重组质粒pHSV1-tk/18T;以限制性内切酶Bg1Ⅱ和SaII分别将重组质粒pHSV1-tk/18T和载体pIRES2-EGFP进行双酶切后,用DNA连接酶连接,构建重组质粒pHSV1-tk-IRES2-EGFP;同样的方法,再以限制性内切酶Bg1Ⅱ和Hpa1分别将重组质粒pHSV1-tk-IRES2-EGFP和逆转录病毒载体pDON-AI-2Neo双酶切后,用DNA连接酶连接,构建pDON-AI-2Neo-HSV1-tk-IRES2-EGFP重组质粒；并将逆转录病毒重组质粒进行病毒包装,获得具有感染能力的假病毒颗粒；并分别以脂质体法和逆转录病毒法瞬时转染/感染小鼠骨髓间充质干细胞,观察不同时间点,荧光显微镜下增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)在细胞内的表达；应用RT-PCR方法检测细胞中的HSV1-tk转录水平mRNA的表达情况；通过体外接触式共培养方法,将BMSCs-EGFP-tk细胞和肺腺癌A549细胞以2：1混合比例共培养24-48h后,加入1ug/ml浓度GCV,96h后以MTT方法检测自杀基因系统BMSCs-EGFP-tk/GCV体系对A549细胞体外抑制/杀伤作用。结果：①：重组质粒通过双酶切鉴定和基因测序,结果表明,扩增的HSV1-tk基因序列正确,大小为1131bp,与Gene Bank报告的HSV1-tk基因序列完全一致；②经逆转录病毒包装的重组质粒以RT-PCR技术鉴定检测到HSV1-tk基因的mRNA表达；③利用阳离子脂质体法和逆转录病毒法分别转染／感染P3代小鼠BMSCs细胞,经EGFP荧光表达效率检测和RT-PCR检测鉴定(实验组在1131bp大小均出现电泳条带,同时内参引物在446bp处出现条带,对照组1131bp大小没有出现电泳条带),两种方法均能将外源基因成功导入BMSCs细胞,逆转录病毒法感染效率明显高于脂质体法,差异具有统计学意义(P<0.05)；④BMSCs-EGFP-tk细胞和正常BMSCs细胞两者的形态特征基本一致,且生长特征无明显差别,长期正常培养15d后仍能观察到EGFP荧光表达和HSV1-tk mRNA表达；⑤BMSCs、 BMSCs-EGFP-tk、A549细胞单独培养时,加入1ug/mL浓度GCV共培养96h后,细胞死亡率分别为0、87.42%、0.48%；当BMSCs-EGFP-tk:A549=2:1的比例,加入1ug/mL浓度GCV共培养96h后,细胞实际总死亡率约达90%,而理论总死亡率仅为58.44%。结论：①成功构建了pDON-AI-2Neo-HSV1-tk-IRES2-EGFP重组质粒并转染入小鼠骨髓间充质干细胞；②外源基因HSV1-tk-EGFP对BMSCs的细胞形态和生长状态无影响,且长期培养性状稳定；③BMSCs-EGFP-tk/GCV应用体系在体外对肺腺癌A549细胞系表现出良好的肿瘤抑制/杀伤作用,且旁观者效应明显；④本研究为下一步利用HSV1-tk和EGFP双报告基因及自杀基因显像监测骨髓间充质干细胞功能和肺癌自杀基因治疗的体内实验研究奠定坚实的基础,提供可行性依据。