硫酸软骨素酶ABC及Nogo-66受体拮抗剂联合鼠胚神经干细胞移植对大鼠脊髓损伤修复的实验研究

来源 :西南医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:chenda1982
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目的:研究硫酸软骨素酶ABC(chondroitinase ABC, ChABC)、Nogo-66受体拮抗剂(Nogo-66(1-40) antagonist peptide,NEP1–40)及鼠胚神经干细胞(neural stem cells, NSCs)联合移植对移植神经元轴突的再生、生长以及大鼠损伤脊髓功能修复的作用。  方法:(1)对前期实验冻存的鼠胚神经干细胞进行复苏。体外应用全反式维甲酸(all-trans-retinoic acid, ATRA)(浓度1.0umol/L)诱导NSCs。(2)随机将60只Sprague-Dawleg(SD)大鼠分成6组,每组10只,如实验过程有死亡,及时补充:假手术对照组(只做椎板切除)(A组)、脊髓横断伤对照组(B组)、神经干细胞(NSCs)治疗组(C组)、神经干细胞(NSCs)结合硫酸软骨素酶 ABC(ChABC)治疗组(D组)、神经干细胞(NSCs)结合Nogo-66受体拮抗剂(NEP1-40)治疗组(E组)、神经干细胞(NSCs)结合硫酸软骨素酶 ABC(ChABC)及 Nogo-66受体拮抗剂(NEP1-40)治疗组(F组),对B、C、D、E及F组构建T10水平脊髓完全横断损伤模型。通过5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-Bromo-2-deoxyUridine,Brdu)标记前期经 ATRA诱导培养的 NSCs,以备移植。术后第2天,D组经留置导管注入 ChABC10uL/d(浓度:5U/ml),连续14d;E组经留置导管注入 NEP1-4010uL/d(浓度:1ug/uL),连续14天; F组经留置导管注入 NEP1-4010uL/d(浓度:1ug/uL)和 ChABC10uL/d(浓度:5U/ml),连续14天;A、B和C组经留置导管注入PBS液20uL/d,连续14d;(2)术后第8d,C、D、E及 F组在无菌条件下用微量注射器经留置导管向脊髓横断处蛛网膜下腔注入经 ATRA干预和 BrdU标记的 NSCs10uL(细胞浓度:2×105/uL);A、B组经留置导管向脊髓横断处蛛网膜下腔注入 PBS液10uL;各时间点各组通过注入磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline, PBS)使移植量均等,进行对照。(3)术前及术后不同时间点,用 Basso, Beattie,Bresnahan(BBB)评分和体感诱发电位(Somatosensory evoked potentials,SEP)潜伏期对大鼠后肢神经功能改变进行评价。移植后8w取实验大鼠损伤处脊髓组织制作切片,通过 HE和免疫荧光染色观察损伤处脊髓组织改变、移植 NSCs存活、神经元轴突再生及生长情况。应用SPSS17.0软件进行统计学分析,不同干预处理间交互效应用析因设计方差分析;组间差异采用单因素方差分析,两两比较采用独立样 t检验,统计学检验标准为P<0.05。  结果:(1)移植2w后观察到大鼠瘫痪的后肢功能开始恢复,移植后2w、5w、8w各时间点,移植治疗各组功能恢复均优于损伤对照组,组间BBB评分和 SEP潜伏期差异有统计学意义(P<0.05);组间两两比较结果显示; B组BBB评分和SEP潜伏期改善情况与C、D、E及F组相比较差(P<0.05);在移植治疗各组中,F组神经功能的恢复最明显,F组与C、D及 E组相比,具有较高的 BBB评分和较短 SEP潜伏期(P<0.05),且ChABC和NEP1–40联合NSCs移植的效应估计值大于两者单独联合NSCs移植的效应之和。(2)移植后8w,HE染色显示:假手术组:组织形态、细胞结构完整,细胞排列规则;损伤对照组:组织结构严重破坏,细胞排列不规则,大量细胞结构溶解、消失,可见较大的囊腔以及较多胶质瘢痕;各移植组:毛细血管及细胞增生明显,见较小囊腔,尤其联合移植组更明显。(3)免疫荧光染色显示:仅C、D、E及F组内可见橘红色Brdu标记阳性细胞,Brdu标记阳性细胞数组间比较差异有统计学意义(P<0.05);组间两两比较结果显示:F组阳性细胞数多于 C、D和 E组,差异具有统计学意义(P<0.05)。MAP-2标记阳性细胞数,损伤对照组和移植治疗各组之间相比差别有统计学意义(P<0.05);组间两两比较结果显示:C、D、E、F组多于 B组,F组多于 C、D、E组,差异有统计学意义(P<0.05);MAP-2阳性细胞面积,损伤对照组与移植治疗各组组间比较有差别(P<0.05);组间两两比较结果显示:C、D、E、F组MAP-2标记阳性细胞面积大于 B组, F组大于 C、D、E组,差异有统计学意义(P<0.05),且ChABC和NEP1–40联合NSCs移植的效应估计值大于两者单独联合NSCs移植的效应之和。  结论:(1)ATRA诱导培养的 NSCs移植、NSCs联合 ChABC移植和NSCs联合 NEP1-40移植均能促使大鼠脊髓损伤功能的恢复。(2) ChABC和 NEP1-40联合 NSCs共同移植对损伤脊髓处神经元轴突的再生与生长、对 SCI功能恢复的促进作用优于单一的 NSCs移植、NSCs联合ChABC和NSCs联合NEP1-40移植组。(3)ChABC和NEP1–40在联合NSCs治疗损伤脊髓中具有协同促进作用。
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