唇腭裂是口腔颌面部最常见的先天性畸形,在中国,唇腭裂位居先天性畸形类型的第二位.先天性唇腭裂不仅影响患儿的容貌,而且可造成患者进食、语音和听觉障碍,影响患儿的智力发育甚至危及生命,对家庭和社会造成了沉重的精神压力和经济负担.所以,研究先天性腭裂发生的原因和形成机制,可为及早对其进行有效的防治提供科学的依据.引起先天性腭裂发生的原因包括遗传因素和环境因素,约20％腭裂归因于遗传因素,剩余的80％以上原因未知.腭的发生是包括舌的下降、双侧腭板的上抬、粘连、融合等一系列复杂事件成功整合的结果.腭突发育的任一阶段受到干扰如腭突生长缺陷,腭突上抬的延迟或失败,腭突融合、腭中嵴上皮细胞死亡、间充质固化和分化等过程的失败,均会导致腭裂的发生.目前研究中存在的主要问题,一是动物模型的选择.鉴于大多数动物自发性腭裂罕见,又由于遗传因素在腭裂中起重要作用.故以往的研究均选用自发率高的A系小鼠(如A/J,A/Wysn,A/He等),但是腭裂最高自发率为20％左右,这给腭裂机制研究的取材造成一定的困难.二者仅对某一特定时间点单个基因作用的进行了观察.哺乳动物腭发育过程的复杂性决定了腭裂发生不是一个或几个基因突变或表达改变的结果;仅对单个基因或少数基因的研究无法确定起关键作用的基因及其基因之间的关系,因而难以阐明畸形发生的分子机制.因此,腭裂发生分子机制的研究必需建立适当的动物模型,从基因组水平进行研究.该研究选用N—甲基—N—乙基—甲基亚硝基胍(MNNG)和视黄酸(RA)两种具有代表性的化学物,在畸形发生敏感期即腭发生期给予小鼠,通过大体形态及光镜、电镜等技术手段确定腭裂异常发育表型,建立小鼠腭裂异常发育模型动物;采用SSH这种基于基因组的差异表达基因分析方法,筛选、鉴定腭裂差异表达基因;通过比较正常小鼠和腭裂小鼠基因表达谱,确定腭裂发生相关基因,初步揭示化学物致腭裂发生的可能分子机制,从而为进一步阐明腭裂发生的分子机制提供依据.一、RA和MNNG致小鼠腭裂动物模型的建立;甲基亚硝基胍(N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine,MNNG)同时具有致突变性、致癌性和致畸性,是代表性致突变性致畸物之一.二、MNNG和RA致小鼠腭裂畸形差异表达基因的筛选和鉴定;该研究应用SHH技术对孕期16天的小鼠腭裂畸形和对照组相应的腭突的差异表达基因进行筛选.然后通过克隆、兰白斑筛选、点杂交等技术对筛选的差异基因进行验证,对杂交有差异的克隆进行测序和数据库查询,确定腭裂畸形相关基因.三、化学物致腭裂发生的可能分子机制;在哺乳动物肢的发育中存在着Gpc3与Bmp4、Bmp2、Wnt和Fgfs共表达现象,Gpc3在肢的发育中可调节细胞对Bmp4的反应.以往研究表明在腭的发生过程中存在受Msx1调控涉及到Shh和Bmps信号的基本网络,通过Msx1、Shh和Bmps之间的相互作用调节着间充质细胞的增殖.该研究结果显示RA和MNNG诱致的腭裂中有Gpc3的抑制表达,而且肢和颌面的发育具有一定的相似性,故推测腭裂发生中存在这样一种基因调控网络:即Gpc3抑制表达可能使细胞失去对Bmp4的反应而导致了MEE中Shh表达异常进而使间充质中的Bmp2表达下调,间充质细胞增殖减少而使双侧腭板生长受阻形成小腭,在中线处不能接触、融合从而导致腭裂的发生.Gpc3和脊椎动物Shh家族的一些成员可重叠表达,所以Gpc3在腭的发生过程中也可能直接对Shh产生作用抑或Gpc3直接作用于Bmp2使间充质细胞的增殖受到抑制从而导致腭裂的发生.