海马被认为是参与学习和记忆的重要脑区。齿状回是海马的一个亚区,位于齿状回的颗粒细胞发出树突到分子层,接受来自基底前脑的前穿通纤维通路(medial perforantpathway,MPP)神经纤维的支配,同时通过发出轴突到CA3,形成苔藓状纤维通路,支配CA3区锥体细胞,把来自基底前脑的信息,沿CA3-CA1途径进行传递。研究显示,在海马齿状回的颗粒细胞下层(subgranular zone,SGZ),是成年大脑中枢神经系统中具有神经发生(neurogenesis)的两个区域之一,每天大约有9,000个新生神经元,这些新生的神经元多数在成熟之前就死亡,部分存活的发育成熟之后在功能上整合进入相应区域的神经环路发挥生物学作用。新生的神经元主要分化成能合成谷氨酸的颗粒细胞。新生神经元从颗粒细胞下层向分子层方向迁移,形成并发出树突与周围的颗粒细胞之间形成突触联系,同时也与来自基底前脑内侧隔核发出的神经纤维形成突触连接,接受其神经支配,参与学习与记忆的形成。齿状回同时接受来自基底前脑的多种神经纤维,既包括兴奋型谷氨酸能神经纤维、抑制型γ-氨基丁酸能神经纤维,也包括胆碱能神经纤维。越来越多的证据显示,乙酰胆碱是与学习和记忆最为密切的神经递质,胆碱能神经突触更被认为是“记忆突触”。在一些退行性疾病如早老性痴呆,患者在学习和认知方面存在明显缺陷,而且呈现进行性下降。研究证实,患者海马中的乙酰胆碱水平明显降低,同时伴有神经元的丢失,这可能是造成学习和认知缺陷的重要原因。尽管有大量的研究报道,乙酰胆碱和成年神经发生都可能有助于学习和记忆,但在齿状回,新生未成熟的神经元对突触可塑性的作用如何,与成熟神经元相比机制是否相同,以及乙酰胆碱对这两种神经元的作用如何,尚无文献报道。在本研究中,我们进行了以下三部分的观察:(1)采用高频刺激(high frequencystimulus,HFS)分别诱导出新生未成熟神经元和成熟神经元产生的两种不同类型的长时程增强(long-term potentiation,LTP),并对其机制进行了初步分析;(2)采用水迷宫和免疫组织化学法研究了乙酰胆碱对成年神经发生(形成新生神经元)的影响及其在学习和空间记忆中的作用;(3)采用HFS研究乙酰胆碱对齿状回新生未成熟神经元和成熟神经元诱导的LTP的影响及其作用机制。第一部分:成年大鼠齿状回颗粒细胞在长时程增强形成中的作用及其机制为了研究海马齿状回新生未成熟神经元和成熟神经元对LTP的作用及其机制,我们分别在ACSF和GABA能受体拮抗剂Bicuculline(10μM)存在的条件下对急性分离的海马脑片齿状回前穿通纤维通路上进行高频强直刺激,连续观察并记录了刺激海马齿状回前穿通纤维通路诱发的兴奋性突触后电位(field excitory post-synaptic potential,fEPSP)起始阶段的斜率(slope)的变化。结果显示:(1)大鼠海马脑片在单纯ACSF孵育的环境下,首先给予频率为0.05Hz的双脉冲刺激,获得稳定的基线后再给予高频强直刺激(频率100Hz,刺激持续时间500ms,间隔20s一次,重复4次,下同),能够有效诱导出由新生未成熟神经元产生的LTP(ACSF-LTP)。因为在海马齿状回,由于正常的成熟神经元受到GABA能神经纤维的支配及作用,GABA能神经纤维在受到刺激时释放GABA,抑制成熟颗粒细胞的兴奋性,故在没有解除GABA的抑制性作用时,成熟颗粒细胞并不能产生LTP。而对于新生的未成熟神经元来说,GABA对其不发挥抑制性作用,也不抑制其兴奋性。因此,在单纯ACSF孵育的环境下,前穿通纤维通路上高频强直刺激诱导形成的LTP是由新生的未成熟神经元产生。我们记录到在高频强直刺激后第50～60分钟由新生神经元产生的LTP(与基线水平相对照)为107.85±1.34%(N=7)。当预先给予GABA能受体拮抗剂Bicuculline(10μM)10分钟去除GABA对成熟神经元的抑制作用,随后给予高频强直刺激,记录到强直刺激后第50～60分钟诱导产生的LTP(与基线水平对照)为164.67±2.40%(N=8)。此时记录到的LTP应是由成熟的神经元和新生的未成熟神经元共同作用的结果;(2)在分析新生的未成熟神经元诱导产生LTP的机制中发现,当使用NMDA受体亚基NR2B的选择性拮抗剂Ro25-6981(3μM)后结果显示在强直刺激第50～60分钟时记录到的LTP为100.75±2.75%(N=5),与ACSF-LTP相比较,具有统计学差异(P＜0.05);在应用NR2A选择性拮抗剂NVP-AMM077(0.2μM)后发现,强直刺激诱导的LTP在第50～60分钟时为106.53%±1.36%(N=5),与ACSF-LTP相比较,无统计学差异(p＞0.05);(3)采用同样的方法观察Ro25-6981和NVP-AMM077分别与Bicuculline同时给予的情况下对LTP的影响,发现Bicuculline和Ro25-6981同时使用时在强直刺激后第50～60分钟时的LTP为147.56±6.63%(N=6),而NVP-AMM077和Bicuculline同时使用后的LTP仅为109.04±1.93%(N=6);与BIC-LTP相比较,均具有统计学差异(p＜0.05);(4)我们比较了ACSF-LTP和NVP-AMM077+Bicueullin形成的LTP,发现两者之间无统计学差异(T=0.519,P=0.614)。以上结果表明:1.在海马齿状回新生未成熟颗粒细胞和成熟颗粒细胞可以诱发形成两种不同类型的LTP;2.两种LTP形成机制并不相同,新生神经元形成的ACSF-LTP为NR2B受体依赖的,而由成熟神经元形成的LTP则是NR2A受体依赖的;3.新生神经元的活动不受GABA能神经递质的抑制,而成熟神经元的活动则受GABA的抑制。第二部分:乙酰胆碱对大鼠海马成年神经发生和学习的作用观察成年大鼠海马齿状回新生的神经元对突触可塑性具有重要作用,且在该区域有大量的胆碱能神经纤维支配。本研究通过侧脑室注射ACh,观察ACh对海马齿状回颗粒细胞下层(subgranular zone,SGZ)成年神经发生的影响:同时结合Morris水迷宫进行行为学观察,研究ACh对大鼠海马区学习和空间记忆的影响。实验同时设立假试验组和对照组,假试验组给予生理盐水代替ACh,对照组则只麻醉大鼠,不进行任何手术。结果显示:(1)经侧脑室给予ACh 3周后,大鼠在水迷宫的空间定位航行试验中的逃避潜伏期在训练后第3天起就显著低于假手术组和对照组,在开始训练后第5天,三组大鼠逃避潜伏期分别为6.06±0.85s(N=5)、13.15±2.73s(N=5)和11.77±2.00s(N=5)。试验组分别与假手术组、对照组比较,其差别具统计学意义(P＜0.05,N=5),假手术组与对照组之间无统计学差异(P＞0.05);(2)在试验第5天进行的空间搜索试验中,试验组、假手术组和对照组在60s内穿越平台次数分别为7.4±0.51(N=5)、4.2±0.37(N=5)和3.6±0.51(N=5),试验组分别与假手术组和对照组比较都有统计学差异(P＜0.05),假手术组与对照组之间比较无统计学差异(P＞0.05);(3)因为一个新生神经元从增殖到成熟的周期约为4周,因此我们采用核苷酸类似物BrdU和成熟神经元特异标记物CaBP来标记齿状回颗粒细胞层新生的成熟神经元。在给予ACh后第4周即水迷宫试验结束后,观察BrdU+和BrdU+/CaBP+标记的阳性神经元并进行定量分析。结果显示,实验组BrdU+和BrdU+/CaBP+双标的阳性细胞数目为637.00±39.50/hippocampi、491.00±47.29/hippocampi(N=3,n=36),而假手术组和对照组分别为339.00±17.62/hippocampi、305.00±17.62/hippocampi(N=3,n=36)和491.00±47.29/hippocampi、336.00±49.05/hippocampi(N=3,n=36),试验组分别与假手术组和对照组比较都有统计学差异(P＜0.05),假手术组与对照组之间比较无统计学差异(P＞0.05)。以上结果表明,侧脑室给予乙酰胆碱可以增加齿状回新生的神经元的数目,同时也可以提高成年动物海马的空间学习和记忆,而新生神经元的增加可能有助于学习和记忆过程。因此,本研究提示乙酰胆碱可能通过促进海马齿状回区成年神经发生形成更多的新生神经元来增强学习和空间记忆的能力。第三部分:乙酰胆碱对齿状回长时程增强的作用及其机制研究LTP是一种由强直刺激作用于兴奋性突触传递通路诱发的突触传递效率长时间增强的现象,被认为是形成学习和记忆的细胞水平的具有代表性的作用机制和常用的实验模型。前两部分研究结果显示,乙酰胆碱可以增强齿状回成年神经发生,而在齿状回的新生神经元和成熟神经元对突触的可塑性有着不同的机制。本研究在前两部分研究结果的基础上,利用在急性分离的海马脑片上进行场电位记录的方法,观察和研究胆碱能受体激动剂carbachol(CCh)对齿状回两种神经元前穿通纤维通路上诱导的LTP的影响及其作用机制。结果显示:(1)CCh对前穿通纤维通路上记录的fEPSP具有剂量依赖性抑制作用。采用3个不同剂量的胆碱能受体激动剂CCh(0.1μM、1μM、10μM),分别作用于急性分离的海马脑片10分钟。在灌流开始后第3分钟,fEPSP的幅值开始下降,在第7～10分钟期间时,3个剂量组下降幅度分别为8.60±0.73%(0.1μM,N=3),18.17±0.58%(1μM,N=3)和34.31±1.04%(10μM,N=3);10分钟后立即洗脱CCh,fEPSP逐渐向基线水平恢复;(2)在诱导ACSF-LTP的模式下,强直刺激前先给予CCh(1μM)10分钟,在强直刺激诱导后第50-60分钟时的LTP为99.83±2.14%(N=5),这与ACSF-LTP(107.85±1.34%,N=7)比较有统计学差异(P＜0.05);(3)同样的过程应用于诱导BIC-LTP模式下,即同时给予CCh和Bicuculline 10分钟,在强直刺激后诱导后第50～60分钟时的LTP为82.59±5.85%(N=8),高于只有Bicuculline时的LTP(164.67±2.40%,N=8),两者间有统计学差异(P＜0.05)。同时给予CCh、Bicuculline和M型胆碱能受体拮抗剂阿托品(10μM)10分钟,在强直刺激诱导后第50～60分钟时的形成的LTP为151.66±5.76%(N=4),三者两两比较都具有统计学差异(P＜0.05)。以上结果表明,胆碱能受体被激活后可以易化由齿状回成熟神经元形成的LTP,该作用可以被M型胆碱能受体拮抗剂所抑制。尽管在前面的试验中我们看到乙酰胆碱可以促进新生神经元的形成,但对新生未成熟神经元形成的LTP,ACh则发挥了抑制作用,其机制尚不明确,有待进一步研究。结论:本研究利用免疫组化、水迷宫行为学观察和离体脑片场电位记录等手段,观察和比较齿状回新生未成熟神经元和成熟神经元在前穿通纤维通路上对LTP和突触可塑性的贡献及其机制研究,以及乙酰胆碱对两种神经元诱导的突触可塑性的影响以及对学习和空间记忆的作用。结果发现:1.在海马可引出由新生未成熟神经元和成熟神经元产生的两种不同类型的LTP;2.两种LTP机制不同,由新生未成熟神经元形成的LTP为NR2B受体依赖的,而由成熟神经元形成的LTP则是NR2A受体依赖的;3.新生神经元的活动不受GABA能神经递质的抑制,而成熟神经元的活动则受GABA的抑制;4.ACh可增加齿状回新生的神经元的数目,也可提高动物海马的空间学习和记忆,而新生神经元的增加可能有助于学习和记忆过程;5.ACh通过M型受体易化由成熟神经元形成的LTP,但对新生神经元形成的LTP却发挥抑制作用。