三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)作为我国重要的淡水珍珠贝,具有非常高的经济价值。在珍珠养殖过程中,插片移植是人工培育珍珠过程中的核心环节。供体贝的外套膜细胞小片插入受体贝中,刺激外套膜分泌珍珠质,一层薄薄的上皮细胞逐渐生成并包裹着小片形成珍珠囊,然而育珠贝在移植后一般会对外源的外套膜细胞小片产生免疫排斥,同时机体还受到外部环境中的病原细菌的危害,插片移植后的受体贝很有可能产生脱片,感染病菌发生炎症反应甚至导致死亡。因此,为了获得高产量和高质量的珍珠,我们需要准确掌握插片手术后育珠贝和外套膜细胞小片的生理免疫状态的变化,全面了解珍珠囊发育时期的免疫因子调节机制,在珍珠囊形成的关键时期采取有效的护理措施,为推动珍珠行业的高效可持续发展提供科学理论依据。本文利用二代测序技术,对三角帆蚌进行插片手术后,收集了0h,2h,6h,12h,24h,48h,96h,7d,14d和30d十个时期的珍珠囊样品,构建了三角帆蚌珍珠囊发育转录组文库。组装软件拼接后,获得了293863条平均长度为588bp unigenes,最长的为27255bp,N50读长为840bp,其中27176条unigenes在数据库中得到了注释。将unigenes映射到KEGG代谢途径后,我们发现Toll样受体信号通路、补体与凝血级联反应、NOD受体信号通路、B细胞受体信号通路、趋化因子信号通路等15条涉及免疫功能的代谢通路在KEGG子类别中也被鉴定出来。紧接着,将珍珠囊10个时期的转录组文本集两两对比,筛选鉴定得到4878条差异基因(DEGs)。依据DEGs的珍珠囊发育时空表达谱,构建二维主元分析图和聚类分析热图,分析后推测插片移植后细胞小片和育珠贝的生理状态恢复正常需要一个月。同时,我们将移植手术后育珠贝的生理状态分为6个阶段:0h,2h-6h,12h-24h,48h-7d,14d,30d,并重点研究0/2h,6 h/12 h,24 h/48 h,7 d/14 d和14 d/30d这五组差异基因表达和调控机制。通过对关键时间点差异基因的Gene ontology(GO)和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)富集分析,发现各对比组的差异基因显著富集在补体与凝血级联反应、MAPK信号通路、TLR信号通路和几丁质代谢通路中,对此展开具体讨论。此外,本文选取了8条免疫差异基因进行实时荧光定量验证,线性相关系数r值分布在0.86到0.97之间,表明荧光定量验证结果和测序结果具有高度一致性,进而证明了转录组测序结果的准确性。基于以上分析结果,本文利用分子生物学、细胞生物学等手段,重点研究了Toll样信号通路中的免疫差异基因Interleukin-1 receptor-associated kinase 4(IRAK4)和Tumor necrosis factor receptor-associated factor 6(TRAF6)。首先克隆了三角帆蚌IRAK4基因,该基因的cDNA全长2595bp,开放阅读框1674bp,编码了557个氨基酸蛋白序列,预测的蛋白分子量为62.3 kDa,理论等电点为5.34。HcIRAK4蛋白高度保守,含有一个N端死亡结构域(DD,5–115aa)、以及丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸蛋白激酶结构域(STYKc,270–553aa)。荧光定量PCR显示HcIRAK4的mRNA在组织中的表达具有广谱性,在血细胞、鳃和斧足中高表达。嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)和脂多糖(lipopolysaccharides)感染三角帆蚌后,HcIRAK4转录水平在血细胞中的显著上升表明其参与了机体对外界病原菌的免疫防御,同时也检测到HcMyD88与HcIRAK4的表达模式相似,我们推测TLR信号通路参与了微生物入侵后机体早期的免疫应答。亚细胞定位实验表明,HcIRAK4广泛分布在细胞质中。在HEK293T细胞中过表达HcIRAK4重组质粒,双荧光素酶报告基因实验结果说明HcIRAK4蛋白对报告基因的转录活性无影响,但会显著抑制由HcMyD88诱导激活的NF-?B和AP-1的转录活性,据此推断在低等生物的TLR信号转导途径中可能存在着IRAK4负反馈调节机制。三角帆蚌TRAF6基因全长3986bp,编码654个氨基酸序列,包含N端的RING、两个锌指结构域、一个C端卷曲螺旋的α结构域和一个保守的MATH结构域,这些功能结构域在进化过程中十分保守。荧光定量PCR显示HcTRAF6的mRNA转录本在所有组织中组成型表达,积极响应嗜水气单胞菌和脂多糖对机体的免疫刺激。双荧光素酶报告基因实验显示HcTRAF6蛋白能以剂量依赖型显著激活转录因子NF-κB。另外,借助RNA干扰技术有效敲减HcTRAF6后,再用致病菌嗜水气单胞菌刺激机体,发现抗菌肽基因的表达被抑制,同时机体对体内细菌的清除能力也下降了。