目的：本研究以脉络学说为指导,通过高脂饮食联合链脲佐菌素(STZ)并结扎剪断股动、静脉建立糖尿病足大鼠模型,观察通心络(TXL)联合外周血间充质干细胞(Peripheral blood derived mesenchymal stem cells, PB-MSCs)治疗后大鼠的血糖、血脂、下肢血管血流影像变化;通过观察炎症和氧化应激相关指标、晚期糖基化终末产物的变化及血管新生相关因子的表达,探讨TXL联合PB-MSCs移植治疗糖尿病足促血管新生的可能作用机制。通过上述研究以期为糖尿病足的治疗提供新的治疗方法。方法：1 脉络学说指导糖尿病足理论探讨脉络学说是导师提出的指导血管病变防治的系统理论,脉络学说以胸痹心痛、中风、心悸、心积、心水、心痹、消渴、脱疽等为主要研究领域,涵盖了现代心脑血管病、糖尿病及其血管并发症、周围血管病变等重大疾病。既往基于中医脉与西医血管,脉络与中小血管,脉络末端之孙络与微血管、微循环之间的密切相关性,提出“脉络-血管系统病”新概念。糖尿病足是糖尿病日久累及肢体大、中、小、微血管的一类并发症,属于中医“消渴脱疽”范畴,亦属于“脉络-血管系统病”研究的范畴。本文理论研究以脉络学说为指导,围绕糖尿病足“脉络-血管病变”,通过探讨改善缺血区的微环境,促进血管新生与侧支循环建立,为通络联合干细胞治疗糖尿病足提供理论指导。2 通心络联合外周血间充质干细胞移植治疗糖尿病足大鼠的作用研究采取高脂饲养联合35mg/kg STZ腹腔注射建立糖尿病大鼠模型,成模大鼠结扎并剪断右下肢股动、静脉建立糖尿病足大鼠模型,以同批次正常大鼠复制下肢缺血模型为对照,分别设为正常组(Normal)和对照组(Control,单纯手术组),糖尿病足大鼠随机分成6组：糖尿病足模型组(Model,模型组),通心络组(TXL),西洛他唑组(Cilostazol),外周血间充质干细胞组(PB-MSCs,干细胞组),通心络联合外周血间充质干细胞组(T-MSCs,通心络联合干细胞组),西洛他唑联合外周血间充质干细胞组(C-MSCs,西洛他唑联合干细胞组),PB-MSCs.T-MSCs及C-MSCs予干细胞移植,干细胞移植方法：术后第3天在缺血下肢皮下肌层分8个位点间距5mm,每个点注射0.05mL细胞悬液(PB-MSCs 1.0×106/mL),避血管注射;余组给予等体积无菌RPM1640培养基注射。术后第3天开始灌胃,通心络组和T-MSCs给予通心络0.4g/kg,西洛他唑组和C-MSCs给予西洛他唑18mg/kg,余组给予等体积0.5%羧甲基纤维素钠,每日1次,连续治疗28天。分别在治疗7天、28天时,腹主动脉取血分离血清,观察大鼠的血糖,血脂,放射免疫测定法(RIA)检测空腹胰岛素(FINS)以计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)口胰岛素敏感指数(Ln(ISI)),激光多普勒血流灌注成像(LDPI)检测下肢血流,动脉造影检测下肢血管变化。3 通心络联合外周血间充质干细胞移植对糖尿病足大鼠炎症反应、氧化应激及晚期糖基化终末产物的影响造模方法同第二部分,同批次正常大鼠复制下肢缺血模型为对照,设为对照组(Control,单纯手术组),糖尿病足大鼠分组、给药及取材同第二部分,RIA法检测血清白介素-1(IL-1)、白介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平,化学法检测血清超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)及晚期糖基化终末产物(AGEs)水平,HE染色及透射电镜观察各组大鼠肌组织结构变化,Western Blot方法检测肌组织细胞间黏附分子-1(ICAM-1)和血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)蛋白表达。4通心络联合外周血间充质干细胞移植治疗糖尿病足大鼠促血管新生的机制研究实验造模、分组、给药及取材方法同第三部分,酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测血清血管内皮生长因子A(VEGF-A)和缺氧诱导因子-1α(HIF-α)水平,透射电镜观察肌组织中血管内皮细胞状态,Real-time PCR检测肌组织VEGF-A和细胞周期蛋白(cyclinD1)基因表达,Western Blot检测肌组织CD34、CD105、VEGF-A、血管内皮生长因子受体2(VEGF-R2)、 p-Akt、磷酸化糖原合成酶激酶-3β(p-GSK-3 p)及cyclinD1蛋白表达。结果：1通心络联合外周血间充质干细胞移植治疗糖尿病足大鼠的作用研究1.1各组大鼠血糖、血脂、FINS、HOMA-IR及Ln(ISI)的变化治疗7天、28天时,与对照组比较,模型组血糖显著升高,血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)及低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平显著升高,高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平显著降低,血清FINS降低,HOMA-IR升高,Ln(ISI)降低,差异均有统计学意义(P<0.011)。与模型组比较,各用药组大鼠血糖有降低趋势但差异无统计学意义(P>0.05)、血清FINS变化无统计学意义(P>0.05);TXL和T-MSCs血清TC, TG及LDL-C水平降低,HDL-C水平升高,HOMA-IR降低,Ln(ISI)升高(P<0.05,P<0.01)。与PB-MSCs比较,TXL和T-MSCs7天时血清HDL-C水平显著升高(P<0.01),28天时血清TG, LDL-C水平降低及血清HDL-C水平升高(P<0.05,P<0.01)。治疗28天时,与C-MSCs比较,T-MSCs血清TG水平降低和HDL-C水平升高(P<0.05,P<0.01)。1.2各组大鼠不同时间点血流差值比的变化术前,各组间血流差值比差异无统计学意义(P>0.05)。术后即刻,与正常组比较,对照组、模型组、各用药组缺血下肢血流灌注量显著减少,血流差值比均显著增高(P<0.01)。治疗7天,与正常组比较,对照组血流差值比显著增高(P<0.01);与模型组比较,各用药组缺血下肢血流灌注量显著增加,血流差值比显著减少(P<0.01),T-MSCs缺血下肢血流灌注量多于TXL和Cilostazol (P<0.05)。治疗28天,与正常组比较,对照组血流差值比明显增高(P<0.01);与对照组比较,模型组血流差值比显著增高(P<0.01);与模型组比较,各用药组缺血下肢血流灌注量显著增加,血流差值比显著减少(P<0.01),其中T-MSCs缺血下肢血流灌注量多于TXL、Cilostazol和PB-MSCs (P<0.05, P<0.01)。1.3各组大鼠下肢动脉造影变化正常组大鼠下肢动脉造影血流通畅,血管显示清晰,末端小动脉显影清晰。与对照组比较,模型组大鼠动脉造影血流缓慢,有少量侧支循环形成,并相互连接成毛细血管网,但末端小动脉显影减弱。与模型组比较,各用药组大鼠动脉造影显示血流及末端小动脉显影均有不同程度改善,有侧支循环形成及毛细血管网形成,其中T-MSCs造影血流通畅,末端小动脉显影最清晰。2通心络联合外周血间充质干细胞移植治疗对糖尿病足大鼠炎症反应、氧化应激和晚期糖基化终末产物的影响2.1 HE染色普通光学显微镜观察各组大鼠缺血下肢肌组织病理变化对照组肌纤维排列稍有紊乱,偶可见肌间质纤维化,少量炎细胞浸润。模型组肌纤维排列紊乱明显,肌间质部分纤维化,炎细胞浸润明显。各用药组肌纤维排列、肌间质纤维化及炎细胞浸润较模型组减轻,其中TXL和T-MSCs减轻较明显。2.2透射电镜观察各组大鼠缺血下肢肌组织超微结构对照组：肌节、肌丝排列整齐,结构清晰,少部分线粒体双层膜结构模糊不清,肌浆网轻度扩张,肌膜完整。模型组：部分肌丝融合、模糊、增宽,肌原纤维稀疏、间隙增宽、有断裂,部分线粒体水肿,嵴结构断裂、溶解,空泡变性,可见髓体样化改变,外膜局部溶解、消失,内质网有扩张,肌细胞核间隙增宽。各用药组：上述肌组织超微结构均不同程度减轻,以TXL和T-MSCs吉构病变减轻较为明显。2.3各组大鼠血清IL-1.IL-6及TNF-α水平比较与对照组比较,模型组血清IL-1、IL-6和TNF-α水平均显著增加(P<0.01)。与模型组比较,PB-MSCs血清IL-1、IL-6和TNF-α水平有下降趋势但差异无统计学意义(P>0.05);余用药组血清IL-1、IL-6和TNF-α水平均明显降低(P<0.05,P<0.01)。2.4各组大鼠血清SOD和MDA水平比较与对照组比较,模型组血清SOD水平显著降低、MDA水平显著升高(P<0.01)。与模型组比较,各用药组血清SOD水平均明显升高、MDA水平均明显降低(P<0.05,P<0.01)。2.5各组大鼠血清AGEs水平比较与对照组比较,模型组血清AGEs水平显著升高(P<0.01)。与模型组比较,PB-MSCs血清AGEs水平有下降趋势但差异无统计学意义(P>0.05),余用药组血清AGEs水平均明显降低(P<0.05)。2.6各组大鼠缺血下肢肌组织中ICAM-1和VCAM-1蛋白表达比较与对照组比较,模型组肌组织中ICAM-1和VCAM-1蛋白水平显著升高(P<0.01)。与模型组比较,PB-MSCs肌组织中ICAM-1和VCAM-1蛋白水平有下降趋势但差异无统计学意义(P>0.05),余用药组肌组织中ICAM-1和VCAM-1蛋白表达降低(P<0.05,P<0.01),其中T-MSCs肌组织中ICAM-1和VCAM-1蛋白水平最低。3通心络联合外周血间充质干细胞移植治疗糖尿病足大鼠促血管新生的机制研究3.1透射电镜观察糖尿病足大鼠缺血下肢肌肉微血管内皮细胞超微结构对照组：内皮细胞完整,结构清晰,少部分细胞外基质膜模糊。模型组：内皮细胞结构基本完整,细胞内线粒体少部分膜模糊不清,细胞间隙稍扩张,细胞外基质松散、不连续,部分区域溶解。各用药组：与模型组比较,TXL和Cilostazol内皮细胞超微结构不同程度减轻;PB-MSCs内皮细胞结构不完整,大部分细胞外基质缩窄、闭合、溶解、消失,管腔极度狭窄;T-MSCs和C-MSCs可见新生血管内皮细胞。3.2各组大鼠缺血下肢肌组织CD34和CD105蛋白表达比较与对照组比较,模型组肌组织中CD34和CD105蛋白表达显著降低(P<0.01)。与模型组比较,各用药组肌组织中CD34和CD105蛋白表达均显著升高(P<0.01)。其中T-MSCs肌组织中CD34和CD105蛋白表达最高。3.3各组大鼠血清VEGF-A和HIF-1α水平比较与对照组比较,模型组血清VEGF-A和HIF-1α水平显著降低(P<0.01)。与模型组比较,各用药组血清VEGF-A水平均明显升高(P<0.05, P<0.01), T-MSCs和C-MSCs血清中HIF-1α水平显著升高(P<0.01)。与PB-MSCs比较,T-MSCs和C-MSCs血清中HIF-1α水平明显升高(P<0.05)。3.4各组大鼠缺血下肢肌组织中VEGF-A和VEGF-R2蛋白表达比较与对照组比较,模型组肌组织中VEGF-A和VEGF-R2蛋白表达显著降低(P<0.01)。与模型组比较,各用药组肌组织中VEGF-A和VEGF-R2蛋白表达均显著升高(P<0.01)。各用药组组间比较,PB-MSCs肌组织中VEGF-A和VEGF-R2蛋白表达均高于Cilostazol (P<0.05); T-MSCs和C-MSCs肌组织中VEGF-A和VEGF-R2蛋白表达均高于TXL、Cilostazol及PB-MSCs (P<0.01)。3.5各组大鼠缺血下肢肌组织中VEGF-A和cyclinD1 mRNA表达比较与对照组比较,模型组肌组织中VEGF-A和cyclinD1 mRNA表达显著降低(P<0.01)。与模型组比较,各用药组肌组织中VEGF-A和cyclinD1mRNA表达均明显升高(P<0.01)。各用药组组间比较,PB-MSCs肌组织中VEGF-A和cyclinD1 mRNA表达高于TXL和Cilostazol (P<0.05); T-MSCs和C-MSCs肌组织中VEGF-A和cyclinD1 mRNA表达高于TXL、 Cilostazol及PB-MSCs (P<0.01)。3.6各组大鼠缺血下肢肌组织中cyclinD1、p-Akt和p-GSK-3β蛋白表达比较与对照组比较膜型组肌组织中cyclinD1和p-Akt蛋白表达显著降低,p-GSK-3β蛋白表达显著升高(P<0.01)。与模型组比较,各用药组cyclinD1和p-Akt蛋白表达均显著升高,p-GSK-3β蛋白表达均显著降低(P<0.01)。各用药组组间比较,PB-MSCs肌组织中cyclinD1和p-Akt蛋白表达高于TXL和Cilostazol(P<0.01,P<0.05),T-MSCs和C-MSCs肌组织中cyclinD1和p-Akt蛋白表达高于TXL、Cilostazol及PB-MSCs,p-GSK-3β蛋白表达低于TXL、Cilostazol及PB-MSCs (P<0.05, P<0.01)。结论：1本研究以脉络学说为指导,从“脉络-血管”保护切人,提出通络干预防治糖尿病足作用可通过改善干细胞移植的缺血区局部微环境、促进治疗性血管新生及侧支循环建立,有效治疗糖尿病足。2在增加糖尿病足大鼠缺血下肢血流灌注量、侧支循环建立方面,通心络联合外周血间充质干细胞移植治疗优于单纯干细胞组,同时可以改善糖尿病足大鼠体重,降低HOMA-IR,增高Ln(ISI),降低脂质代谢紊乱。3通心络联合外周血间充质干细胞可减轻炎症水平,提高抗氧化能力,减少晚期糖基化终末产物堆积,减轻肌组织损伤病理及超微结构变化,其抗炎能力优于单纯干细胞组,提示通心络可能通过减轻炎症反应和氧化损伤,进而改善干细胞移植后的微环境,提高外周血间充质干细胞局部肌肉移植后血管新生。4外周血间充质干细胞可通过提高VEGF-A、HIF-1α及VEGF-R2表达,激活p-Akt、抑制p-GSK-3β蛋白表达及上调cyclinD1表达,进而促进内皮细胞增殖、分化形成新生血管。通心络联合外周血间充质干细胞移植上述作用优于单纯干细胞移植,提示通心络可调节HIF/VEGF及PI3K /Akt信号通路,提高干细胞移植后向内皮细胞增殖、分化的作用。