机体对外来抗原和自身抗原的应答或对所谓“危险信号”的反应会打破内环境的稳定，因此机体免疫系统必须具备有效的内部调节功能。调节性T细胞（regulatory T cell，Treg）是近年来受到广泛关注的一类由多种亚群组成的具有免疫调节功能的T细胞，包括CD4+Treg、CD8+ Treg以及γδT细胞等。其中研究较多的是CD4+Treg。2003年Bluestone提出根据来源、特异性和效应机制，CD4+Treg可划分为天然调节性T细胞和获得性调节性T细胞。其中天然调节性T细胞由前体细胞在胸腺自然分化而来，表面持续表达高水平的CD25分子，同时转录因子Foxp3是该亚群的标志（CD4+CD25+Treg）。 CD4+CD25+Treg抑制功能的分子机制研究是该领域的热点之一。研究发现，该细胞发挥抑制功能有细胞接触非依赖性的和依赖性的两种模式。细胞接触非依赖性模式主要由IL-10和TGF-β介导，而细胞接触依赖性的抑制功能的机制尚未完全明确。我们在前期工作中发现CD4+CD25+Treg和靶细胞共培养后存在着细胞凋亡的现象。为了阐明CD4+CD25+Treg的细胞接触依赖性的抑制现象中Treg的杀伤作用及其机制，我们建立了体外活化CD4+CD25+Treg的模型，研究了Treg的杀伤作用及其分子机制，并分析了其体内的作用和意义。具体研究内容和结果如下： 1．分离、纯化和鉴定CD4+CD25+Treg。免疫磁珠MACS分离小鼠静息CD4+CD25+T细胞（FACS鉴定其纯度达97％以上），RT-PCR及细胞内染色检测证实CD4+CD25+T细胞高表达Foxp3；通过体外细胞增殖实验证实CD4+CD25+T细胞对CD4+CD25-T细胞增殖有抑制作用，同时发现共培养的细胞比单独培养的细胞出现较高的凋亡率。 2．建立CD4+CD25+Treg的体外活化模型。以CD3/CD28单克隆抗体及IL-2联合作用下体外活化培养上述来源的CD4+CD25+Treg，经培养后的CD4+CD25+Treg形态学发生显著改变，FACS检测其上调表达活化标志CD69、MHCII，下调CD62L的表达。该群细胞分能抑制CD4+CD25-T细胞的增殖；活化的CD4+CD25+Treg与活化的CD4+CD25-T细胞共培养后凋亡率为43．15％，而活化的CD4+CD25+Treg的自发凋亡率为12．50％，活化CD4+CD25-T细胞的自发凋亡率为17.39％. 3．明确了活化的CD4+CD25+Treg的杀伤作用。活化的Treg对活化的CD4+CD25—T细胞的杀伤作用呈现出时间效应关系：活化的Treg与活化的CD4+CD25—T细胞以1：1的比例共培养4h、8h和24h后CD4+CD25—T细胞的7—AAD阳性率分别为32．56％、44．22％和64．52％，而单独CD4+CD25—T细胞的7—AAD阳性率分别为13．34％、14．96％和20．29％；并发现活化的Treg对体外活化培养的CD4+CD25—T细胞的杀伤作用呈现一定的效靶比；同时发现活化的CD4+CD25+Treg不能杀死新鲜分离的CD4+CD25—T细胞或单独用IL—2培养的CD4+CD25—T细胞，新鲜分离的调节性T细胞对活化的CD4+CD25—T细胞或新鲜分离的CD4+CD25—T细胞同样没有杀伤作用。 4．CD4+CD25+Treg的杀伤作用是细胞直接接触依赖性、MHC非限制性并和TCR特异性无关。我们发现CD4+CD25+Treg对活化CD4+CD25—T细胞发挥杀伤效应为细胞与细胞直接接触依赖性的，其分泌的细胞因子的IL—10和TGF—β的中和抗体不能抑制CD4+CD25+Treg对活化CD4+CD25—T细胞的杀伤效应（P>0．05）；H—2d小鼠来源的CD4+CD25+Treg对H—2b小鼠来源的和H—2d小鼠的来源的活化CD4+CD25—T细胞都具有杀伤作用，且杀伤效果没有显著差异（P>0．05），MHCI的抗体和MHCII的抗体不影响CD4+CD25+Treg对活化CD4+CD25—T细胞的杀伤效应（P>0．05）；来源于TCR特异性转基因小鼠与来源于野生型BALB/c小鼠的CD4+CD25+Treg对活化CD4+CD25—T细胞的杀伤效应无显著性差异（P>0．05）。 5．我们分析了活化的CD4+CD25+Treg的基因表达谱，进一步研究发现CD4+CD25+Treg对CD4+CD25—T细胞的杀伤作用为CD95/CD95L非依赖型。在转录及翻译水平均发现活化后CD95L在CD4+CD25+Treg上调表达，CD95在活化后的CD4+CD25—T细胞上也有上调；但CD95L的中和抗体不能抑制CD4+CD25+Treg对活化CD4+CD25—T细胞的杀伤效应（P>0．05）；来源于CD95L突变的gld小鼠的CD4+CD25+Treg与野生型的CD4+CD25+Treg对活化的CD4+CD25—T细胞的杀伤效应无显著性差异（P>0．05） 6．TRAIL/DR5可能参与了CD4+CD25+Treg对CD4+CD25—T细胞杀伤作用。我们在转录及翻译水平均发现TRAIL在CD4+CD25+Treg显著上调表达，活化后94．35％的Foxp3+Treg细胞表达TRAIL，同时DR5在活化后的CD4+CD25—T细胞上也呈现显著上调；TRAIL的中和抗体及DR5的阻断抗体都可以显著抑制CD4+CD25+Treg对活化CD4+CD25—T细胞的杀伤效应（P<0．01）；caspase抑制剂也能抑制该杀伤效应（P<0．01）：CD4+CD25+Treg与活化CD4+CD25T细胞共培养后以Western Blot发现细胞裂解液中有大量caspase 3剪切体的出现，DR5的阻断抗体可以显著抑制caspase 3剪切体的形成。 7．探讨了CD4+CD25+Treg的杀伤作用在体内的免疫调节作用。通过体内杀伤实验证实了活化的CD4+CD25+Treg在体内对活化的CD4+CD25—T细胞的杀伤作用：经尾静脉输注活化的CD4+CD25+Treg可以使同时输注的活化的CD4+CD25—T细胞数量显著减少，DR5阻断抗体预处理活化的CD4+CD25—T细胞后抑制CD4+CD25+Treg在体内对活化CD4+CD25—T细胞的杀伤效应。将体外活化培养的BALB/c （H—2d）小鼠的活化的CD4+CD25+Treg与活化CD4+CD25—T细胞经尾静脉输注到裸鼠体内，24小时后给裸鼠（H—2d）移植C57BL/6BL/6（H—2b）小鼠和BALB/c （H—2d）小鼠的皮片，观察皮片的存活状态。结果发现，H—2b小鼠的皮片在单独输注CD4+CD25—T细胞的裸鼠体内仅能存活7～12天，而同时输注Treg细胞能显著延长H—2b小鼠皮片的存活（P<0．01）；以DR5阻断抗体预处理过的活化CD4+CD25—T细胞可以一定程度上抑制活化的CD4+CD25+Treg延长皮肤移植物存活效应（P<0．05）。 通过以上的研究，我们得到以下的结论： 1．建立了CD4+CD25+Treg的体外活化模型，明确了活化的CD4+CD25+Treg在体外能杀伤活化的CD4+CD25—T细胞。该杀伤作用依赖于细胞与细胞的直接接触，而不依赖于其分泌的细胞因子IL—10、TGF—β等；杀伤方式可能MHC非限制性和TCR特异性。 2．明确了不同状态的CD4+CD25+Treg杀伤功能相关分子的表达特点，发现CD4+CD25+Treg的杀伤作用可能为CD95/CD95L非依赖型，而TRAIL/DR5途径参与了CD4+CD25+Treg的杀伤作用。 3．活化的CD4+CD25+Treg在体内能杀伤活化的CD4+CD25—T细胞，DR5阻断抗体能抑制该杀伤效应。活化的CD4+CD25+Treg在体内可以显著延长皮肤移植物存活，DR5的阻断抗体可以一定程度上抑制活化的CD4+CD25+Treg延长皮肤移植物存活的效应。