前言自发性蛛网膜下腔出血是一种严重的神经外科急症,总体发病率约6/10万,临床总体死亡率32-67%,占整个卒中患者群死亡率的25%,基于社区和人口的流行病学调查显示大约50%在动脉瘤破裂引起蛛网膜下腔出血后30天内死亡,其中三分之二的死亡病例发生在发病后的48小时,20-30%的存活患者留有残疾。颅内动脉瘤破裂是导致的蛛网膜下腔出血的最主要原因,随着显微外科技术和血管内介入治疗的迅速发展,由于动脉瘤再次破裂造成患者死亡的情况已经明显减少,但蛛网膜下腔出血患者的死亡率仍高达20-50%,约30%的患者在初次蛛网膜下腔出血后数天内死亡。蛛网膜下腔出血也是猝死的重要原因之一,猝死患者约占前循环动脉瘤破裂患者的12%和后循环破裂动脉瘤患者的45%。目前,关于蛛网膜下腔出血脑损伤的机制仍不清楚,尚无特异性的治疗措施。蛛网膜下腔出血后造成的急性脑损伤是患者预后不良的关键因素,但是由于蛛网膜下腔出血累及的脑实质血管管径远小于核磁共振等常规成像技术的分辨率,其损伤机制目前尚不明确。蛛网膜下腔出血造成血脑屏障破坏和脑水肿形成,这些过程与血管内皮收缩和紧密连接分解造成的血管通透性增加有关。无论在对蛛网膜下腔出血患者还是实验动物研究,均发现蛛网膜下腔出血后颅内压急剧升高,导致局部脑血流量显著下降和代谢改变。蛛网膜下腔出血早期脑损害的主要表现为血脑屏障的破坏和脑水肿的形成。近期研究结果表明,蛛网膜下腔出血早期即可出现由于血管管径改变和连续性破坏造成的微循环损伤,血管通透性增加,液体、纤维蛋白和红细胞外渗进入脑实质。文献报道蛛网膜下腔出血后脑微血管通透性增加与继发的迟发脑缺血和不良预后相关,神经元和脑血管内皮细胞的凋亡可能是血脑屏障破坏和脑水肿形成的关键因素。本研究首先通过颈动脉穿刺法建立大鼠蛛网膜下腔出血模型,应用分子生物学和组织学相结合的研究方法,研究急性期蛛网膜下腔出血导致血脑屏障开放的过程,探讨蛛网膜下腔出血后脑微血管损伤及紧密连接蛋白表达的时相性变化规律,明确蛛网膜下腔出血急性期脑损伤的分子生物学机制,旨在为临床靶向治疗急性期蛛网膜下腔出血脑损伤提供依据。材料与方法1、蛛网膜下腔出血模型的制作：S-D成年健康雌性大鼠,体重260-300g。腹腔注射麻醉后沿中线切开,暴露右侧颈动脉鞘。游离右侧颈外动脉,双重结扎后切断。以临时阻断夹阻断颈总动脉和颈内动脉,颈外动脉残段剪小口,取0.26mm直径鱼线经颈外动脉剪口送入颈内动脉,去除颈内动脉阻断夹,将鱼线向前送入1.8cm左右感觉有阻力后再送入2-3mm,去除颈总动脉阻断夹,回撤鱼线,重新结扎颈外动脉残端。2、局部脑血流量(rCBF)的测量：S-D成年健康雌性大鼠,腹腔注射麻醉,正中矢状切开约2cm切口,钝性剥离骨膜,用牙科钻以大鼠冠状缝上中线右旁开5mm为中心各移去一块颅骨(3×3mm),将表皮覆盖在骨窗并缝合上备用。测量时,以超声多普勒血流仪经骨窗测量。3、血脑屏障通透性的测量：于测量前1小时暴露大鼠右侧股静脉,2%伊文氏蓝溶液。通透性的测定采用EB的渗出量定量估计。大鼠10%水合氯醛(3.5ml/kg)腹腔注射麻醉后,制备蛛网膜下腔出血后不同时间点,2%EB (0.2ml/100g)经右股静脉注入大鼠体内,1小时后用肝素化生理盐水经左心室灌流(压力为100-120cmH20,1 cmH2O98 Pa),直至右房流出清澈液体,断头后取脑正中剖开,左右脑称重按10ml/g浸入甲酰胺溶液,在60℃恒温水浴箱中抽提24h,甲酰胺溶液呈现深浅不同的蓝色,脑组织呈现无色透明状,然后在UV300紫外—可见光分光光度计下620nm波长处定量EB在甲酰胺中的OD值,定量分析样本脑组织中EB的含量。纯甲酰胺溶液设为空白对照。4、透射电镜观察血脑屏障开放情况：大鼠麻醉后,每只大鼠用约100ml肝素化生理盐水及4%多聚甲醛200ml灌流固定,取1×1×1mm 3脑组织用2.5%的戊二醛浸泡固定,2%四氧化锇后固定,梯度酒精脱水,环氧树脂618包埋,超薄切片经醋酸铀、枸椽酸铅双重染色后,在80KV条件下用JEM-1200EX型透射电镜观察脑微血管内皮细胞(BMECs)的紧密连接、吞饮小泡数量变化和脑组织超微结构。5、应用S-P免疫组织化学法检测紧密连接蛋白clauding5、Occludin、Zo-1的分布和表达变化。6、应用Western blot法检测蛛网膜下腔出血后不同时间点检测紧密连接蛋白clauding5、Occludin、Zo-1蛋白表达变化。7、应用Western blot方法检测蛛网膜下腔出血后12h内Akt、P-Akt和Foxo1A的表达变化。结果1、成功建立了大鼠蛛网膜下腔出血模型。2、蛛网膜下腔出血后局部脑血流量显著下降,1分钟达到最低,然后缓慢上升,于24h接近对照Omin组,48-72h局部脑血流量再次下降,1w再次接近对照Omin组。3、蛛网膜下腔出血早期即出现血脑屏障通透性的显著升高,3小时最高,24小时接近对照Omin组。48-72h血脑屏障通透性再次显著升高,1w后血脑屏障通透性再次下降。4、透射电镜可见蛛网膜下腔出血后血脑屏障紧密连接开放,出血后3h和72h开放最明显,但未见吞饮小泡数量增加。5、蛛网膜下腔出血后紧密连接相关蛋白Zo-1和Occludin表达显著下调,分别于3h和72h达到最低。Claudin-5和caveolin-1表达无变化。6、蛛网膜下腔出血后早期出现P-Akt表达的显著下调,然后出现Foxo1A和P-Akt表达显著上调,随后恢复对照Omin组水平。结论1、蛛网膜下腔出血后血脑屏障通透性增加,呈现双峰的时相性变化。2、蛛网膜下腔出血后脑微血管内皮细胞紧密连接的开放是血脑屏障通透性变化的原因。3、紧密连接相关蛋白Zo-1和Occludin的表达下调是蛛网膜下腔出血后血脑屏障通透性变化的原因之一4、蛛网膜下腔出血后吞饮小泡数量无增加,caveolin-1表达无变化。5、蛛网膜下腔出血后12h内血脑屏障通透性显著升高,紧密连接相关蛋白Zo-1和Occludin的蛋白表达显著降低,P-Akt蛋白表达先显著降低后显著升高,Foxo1A—过性表达显著升高。6、蛛网膜下腔出血后血脑屏障通透性和紧密连接相关蛋白表达的变化与Akt和Foxo1A的表达变化在时间上的密切关联,提示Akt/Foxo信号通路参与了蛛网膜下腔出血早期血脑屏障通透性变化和紧密连接开放的调控。