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成簇的规律间隔的短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/CRISPR 相关蛋白 9(CRISPR-associated protein 9,Cas9)系统作为第三代基因组编辑技术,能在多个物种中发挥基因编辑作用。CRISPR-Cas9在进行基因编辑过程中除了需要单链引导RNA(single guide RNA,sgRNA)与基因组上的靶序列碱基互补配对外,还需要基因组上的靶序列附近必须存在几个称之为为前间区序列邻近基序(Protospacer adjacent motif,PAM)特异碱基。广泛应用的酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)SpCas9识别PAM主要为NGG,这限制了基因组编辑范围。前期工作表明SpCas9 变体 VQR(D1135V/R1335Q/T1337R)在水稻(Oryza sativa)中识别 NGAT、NGAA和NGAG三种PAM,但仍不确定是否可以识别NGAC PAM。在本研究中,选取原始CRISPR-VQR系统基因编辑效率较低的基因外显子上的靶标位点,采用改进后的CRISPR-VQR系统构建相应的基因编辑载体用以敲除上述靶标位点序列。结果表明,与原始CRISPR-VQR系统相比,改进后的CRISPR-VQR系统对上述基因外显子编辑能力得到显著提高。在此基础上,使用改进后的CRISPR-VQR系统构建基因编辑载体成功在水稻中敲除含有PAM为NGAC的靶位点,得到57株转基因植株,测序结果表明VQR可以高效识别NGAC PAM靶序列,进一步补充了 VQR在基因组中的编辑范围。突变位点分析结果表明,基因突变类型以杂合突变和双等位突变为主。为了评估SpCas9对NGA PAM类型靶标位点的编辑能力,选取了上述VQR敲除PAM类型为NGAC的靶标位点用SpCas9进行基因编辑,成功构建了 SpCas9敲除NGAC的靶标位点的基因编辑载体,采用农杆菌侵染法将载体质粒转入水稻内,通过潮霉素筛选获得转基因愈伤组织,提取转基因愈伤组织DNA,对靶标位点进行测序,结果表明SpCas9对NGAC PAM类型靶标位点的的编辑能力相对较低。这些结果表明,改进的CRISPR-VQR系统可以高效编辑水稻NGACPAM位点,并产生丰富的突变类型。本研究不仅为水稻基因NGAC PAM序列的编辑奠定了基础,而且也为其他植物相关位点编辑提供了重要的参考。