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魔芋是多年生单子叶草本植物,其变态茎富含的葡甘聚糖具有广泛的应用价值。目前魔芋软腐病成为魔芋产业发展的瓶颈,利用基因工程技术获取抗软腐病魔芋新品种成为魔芋软腐病生物防治的有效手段。本研究构建了含有块茎特异性启动子patatin和抗软腐病基因aiiA的植物表达载体,并通过农杆菌介导法遗传转化魔芋,拟以此途径获取抗软腐病魔芋植株。主要包括以下研究内容: 以pET28a为载体质粒,根据GenBank登录号GU339170.1的aiiA基因序列设计引物,以苏云金芽孢杆菌218基因组DNA为模板扩增克隆aiiA基因,构建重组原核表达载体pET28a-aiiA,并利用热激法成功转化大肠杆菌表达菌株E.coli BL21(DE3)。在37℃下培养至菌体OD600至0.4,添加IPTG(0.6mmol/L)并在20℃下分别诱导培养12 h、16 h、20 h、24 h后,超声波破碎菌体提取粗蛋白,经SDS-PAGE检测,可见28 KD大小的目的基因表达产物。经抗魔芋软腐病病原菌活性检测,结果显示蛋白粗提液对魔芋软腐病病原菌生长有明显的抑制作用。 以花魔芋小球茎和根状茎为外植体,以MS培养基为基本培养基,添加不同激素诱导和分化培养,将诱导的魔芋丛生芽切成单株后进行生根培养。本实验中采用愈伤诱导培养基为MS+6-BA1.0 mg/L+NAA1.0 mg/L,新鲜材料接种后50-60天,形成的愈伤组织可用于后续的遗传转化。 以pBI121为载体质粒,根据GenBank登录号GQ352473.1的patatin ClassⅠ基因启动子序列设计引物,从马铃薯幼嫩球茎基因组DNA中克隆块茎特异性启动子patatin。设计含有BamHⅠ单酶切位点的特异引物,从苏云金芽孢杆菌218中克隆aiiA基因。构建含aiiA基因的抗软腐病植物表达载体pBI121-patatin-35S-aiiA和pBI121-patatin-aiiA。利用冻融法,将重组植物表达载体转化到农杆菌LBA4404中,并通过农杆菌介导法,对魔芋小球茎和根状茎诱导形成的愈伤组织进行遗传转化。 采用本课题组已建立的魔芋遗传转化体系,用含有重组植物表达载体pBI121-patatin-aiiA和pBI121-patatin-35S-aiiA的农杆菌遗传分别转化魔芋愈伤组织,将共培养后的愈伤转接至分化培养基筛选抗性愈伤。对筛选分化出的pBI121-patatin-aiiA转化植株进行GUS染色,仅在球茎中可见蓝色斑点,aiiA基因在球茎中特异性表达。对筛选分化出的pBI121-patatin-35S-aiiA转化植株进行GUS染色,PCR检测,PCR-Southern杂交和Southern杂交检测。GUS染色结果显示,叶柄和球茎中可见蓝色斑点,PCR检测,PCR-Southern杂交和Southern杂交结果证明aiiA基因已经整合到魔芋基因组中。