论文部分内容阅读
构巢曲霉(Aspergillus nidulans)是属于子囊菌门(Ascomycota)的一种丝状真菌,其菌丝延伸是所有极性生长中速率最快的模式生物之一,因此是研究决定曲霉侵染性的极性生长和相关信号通路的良好模式生物.已有研究表明钙离子信号通路参与调节构巢曲霉的极性生长和形态建成,然而关于钙离子信号通路的核心调节者calcineurin在调节构巢曲霉极性生长和形态建成方面的作用的认识还很有限。本课题组之前的研究表明,在构巢曲霉中,NDR(nuclear Dbf2-related)信号通路的成员MobB和CotA在细胞极性的建立和维持过程中形成复合体发挥功能,它们之中任何一个缺失,都能够导致菌丝极性生长的缺失和形态缺陷。进一步研究表明,这种极性缺陷渗透逆境条件下可以恢复,然而这种逆境恢复过程依赖钙信号通路。在本文中,通过遗传学及分子生物学方法我们进一步证明：(1)钙离子信号系统成员的基因表达水平及蛋白表达水平在在CotA/MobB缺陷菌株在渗透逆境中恢复极性生长的过程表达量增高,说明钙离子信号通路确实参与了逆境恢复的过程。其中钙调磷酸酶calcineurin的作用尤其重要。不仅参与了逆境恢复过程的转录调控,还能够调控NDR通路中的CotA/MobB基因的表达量。(2) Calcineurin对基因表达的了解作用不仅仅是通过CrzA来完成的,即在逆境响应过程中,CrzA不是calcineurin唯一的下游靶蛋白。(3)通过同源比对找到构巢曲霉中预测的calcineurin相互作用蛋白CdaA、FapA和AkrA:CdaA具有多糖去乙酰化酶位点,并具有N端信号肽及calcineurin结合位点,CdaA缺陷菌株对EGTA、Ca2+、NaCl和LiCl都没有明显的敏感性,但是CdaA/CnaA双缺菌株在Ca2+产孢量相对于CnaA单缺菌株来说具有明显的恢复；FapA具有NF-X1锌指结构,并具有DNA结合序列和N端信号肽,RT-PCR结果显示,FapA确实对钙离子信号通路各组分基因表达具有调节作用,说明FapA为NF-X1转录因子家族成员,FapA缺失菌株相对于野生型来说,对EGTA敏感,对NaCl的敏感性次之,对LiCl的敏感性与野生型相似；AkrA具有N端信号肽及跨膜序列,并具有棕榈酰化酶活性,AkrA缺失菌株对EGTA和LiCl超敏感,对NaCl敏感。(4)细胞壁合成抑制剂Calcoflour White和Congo Red对FapA缺失菌株和AkrA缺失菌株以及它们与CnaA的双缺菌株具有不同的影响,且作用效果明显,说明FapA、AkrA及CnaA在维持细胞壁完整性方面发挥了一定的作用,且在此过程中,它们的功能具有相关性。曲霉的极性生长与其侵染性相关,通过对CdaA, FapA和AkrA在维持细胞正常极性生长、形态建成及离子稳态等方面的作用的研究,可以进一步阐明曲霉与侵染性相关的极性生长的分子机制,为治疗真菌疾病提供理论基础。