一.研究背景新型布尼亚病毒(Severe fever with thrombocytopenia syndrome virus,SFTSV)隶属于布尼亚病毒科白蛉病毒属,是一种新发蜱传病毒,能感染人并引起发热伴血小板减少综合征(Severe fever with thrombocytopenia syndrome,SFTS)。该病是近年来首先发现于我国中部农村地区的一种新发传染病。自2010年首例发现至今,已席卷中国大陆19个省份。周边国家日本和韩国也相继有零星病例报道。另外,有报道称美国从两例患者体内分离出的另一种隶属于白蛉病毒的Heartland病毒,该病毒的基因与SFTSV的基因极为相似。患者在被蜱虫叮咬后,潜伏期一般为5-12天。大多数患者起病急,其主要临床症状为高热(多数为持续性高热,严重的可达到40℃以上)、白细胞计数和(或)血小板计数减少。绝大多数患者预后良好,老年患者、合并慢性疾病者、免疫力低下者及诊断治疗不及时者,感染后病情危重。少数重症患者可因多脏器损伤而死亡,病死率在6.3%~30%之间波动。目前,该病尚无有效的治疗手段。临床医生一般依靠患者的临床特征以及血常规和血生化检测结果,开展针对性治疗。高病毒载量和重症临床结局相关研究,部分诠释了病毒载量在患者预后中起到的重要作用。然而,关于SFTS患者在整个住院期间的病毒载量变化的研究却很匮乏。另一方面,针对SFTSV感染患者在整个病程的免疫反应是增强还是被抑制依旧不清楚,SFTS患者的细胞和体液免疫反应与患者临床预后之间的关系研究很少。二.研究目的掌握SFTS患者在整个住院期间的病毒变化规律,探讨影响病毒载量的因素及其与临床预后的关系。描述SFTS患者的免疫水平及其变化规律,分析患者免疫反应与疾病预后的关系。三.研究方法对于符合SFTS疑似病例纳入标准的患者,开展流行病学问卷调查,收集临床资料信息。收集的血清标本(即患者整个住院期间收集的血清)进行核酸提取。使用荧光定量聚合酶链反应检测SFTSV,根据绘制的标准质粒曲线,对血清阳性标本病毒载量定量检测。对于符合随访病例纳入标准的SFTS病例,填写随访调查表格。每次回访时,对参与者进行常规的血液检查(血生化和血常规检测等)。采集的血清标本,使用酶联免疫法检测方法进行Ig M、Ig G抗体效价测定。另外,在征得参与者同意后,采集5ml EDTA抗凝血,在6小时内进行淋巴细胞分离,用于淋巴细胞和淋巴细胞亚群的检测。四.研究结果基于SFTS病例纳入标准,本研究于2013年4至11月在哨点医院共纳入了208例患者。患者发病第3天,病毒载量均值为3.79±2.38Log10copies/ml;发病第6天,病毒载量达到峰值,为4.29±2.59Log10copies/ml;发病第15天,病毒载量下降至2.13±2.16 Log10copies/m L。患者入院第1天,检测SFTSV的阳性率为44.4%(4/9);发病第3天,阳性检出率最高,达到82.5%(33/40);发病第6天,减少至78.5%(117/149);发病第12天,阳性检出率为57.5%(103/179);发病第18天,阳性检出率降至55.6%(25/45)。病毒载量的峰值与白细胞(White blood cell,WBC)的最低值出现在患者发病的第6天;血小板(Platelet,PLT)的最低值、谷草转氨酶(Aspartate aminotransferase,AST)、乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH)和肌酸激酶(Creatine kinase,CK)的峰值滞后于病毒载量峰值3天,而谷丙转氨酶(Alanine transaminase,ALT)峰值滞后于病毒载量峰值6天。收集的标本PLT计数恢复正常水平时,仍有34.3%(47/137)的标本SFTSV检测为阳性。患者白细胞恢复正常时,55.6%(80/144)的标本可检测到SFTSV。而重要的生化指标AST、LDH和CK恢复正常范围时,SFTSV阳性检出率分别为30.8%(20/65)、34.8%(16/46)和50.7%(76/150);SFTS患者WBC与PLT计数均恢复到正常范围时,仍有30.8%(20/65)患者的SFTSV检测为阳性。对符合随访病例纳入标准的SFTS病例,于2011年5月至2014年4月,共纳入了298例患者。出院后,55名患者参与了长期随访,共收集标本438份。在SFTS患者发病6个月的回访时间里,观察患者出现血小板减少、白细胞减少和乳酸脱氢酶升高各有3例(5.9%),4例(7.8%)和1例(2%)。SFTS患者发病第4天,血清中可以检测到特异的Ig M抗体,患者发病的第4周,Ig M抗体滴度达到峰值,6个月后仍能低水平检出。SFTS患者发病的第4周,Ig M抗体阳性检出率最高(79.4%,27/34);随访第3个月,Ig M阳性检测率为35%(14/40);随访第6个月,Ig M阳性检出率仅为10.9%(6/51);随访进行到第9个月时,无Ig M阳性标本检出。SFTS患者Ig G阳性检出率在随访的第6个月最高(89.1%,49/55),特异性抗体Ig G的滴度达到峰值;随访第9个月时,Ig G阳性检出率为87.3%(48/53);随访第18个月,阳性检出率为87.2%(41/47);随访第30个月,Ig G阳性检出率为84%(21/25)。对纳入病例的外周淋巴细胞亚群检测,发现患者在感染SFTSV的第1周出现T细胞、B细胞和NK细胞显著减少。SFTS重症病例的CD3 T细胞数量可减少至176.8 cells/mm3,其中,CD4可减少至66 cells/mm3,CD8可减少至63cells/mm3。患者在感染SFTSV的第6周,各项外周血淋巴细胞亚群的计数均恢复至正常水平。五.研究结论1.发热伴血小板减少综合征病例住院期间病毒载量的前瞻性研究(1)入院时,55.6%患者SFTSV检测为阴性,提示临床医生在对病人进行临床诊疗过程中,仅依据一次RT-PCR检测结果是不妥的。基于RT-PCR检测SFTSV的诊断手段,在患者发病后的第3天再次进行SFTSV检测,其临床参考意义更可信,同时也可以避免误诊或漏诊的发生。(2)SFTS患者发病第6天,患者体内病毒拷贝量达到峰值,造成人与人之间传播的危险最高。(3)重症患者病毒载量的初始值和峰值远高于轻症患者,特别是入院时间间隔过长的高龄女性患者体内病毒载量更高,病毒排泄速度相对较慢。另外,5例死亡病例的病毒载量的峰值大于107copies/ml,这一数值可以作为阈值,预测患者发生死亡的可能。同时提示临床医生需及时采取临床措施,干预治疗。(4)实验室检测参数WBC、PLT、AST、ALT、LDH和CK的异常变化与患者体内病毒拷贝量有一定的联系,可以作为临床医生诊断和病情分析的辅助参考。2.发热伴血小板减少综合征病例免疫特征的前瞻性研究(1)SFTS病例感染后第1周,其T细胞、B细胞和NK细胞显著减少,免疫系统受到严重损坏,患者体内产生针对SFTSV的特异性的Ig G和Ig M抗体不足,进一步加剧了患者病情的恶化。因此,在患者感染早期,针对性开展免疫功能相关治疗可改善患者预后。(2)Ig M和Ig G抗体滴度在临床诊疗方面有着重要的应用。特异性的Ig M抗体可在发病第4天检测到,第4周达到峰值,监测第6个月已经很难检测到。因此,在发病早期,这一规律可以用来判断病人是否已经存在病毒感染。Ig G抗体在患者发病后第3周可以检测到,第6个月达到峰值。大多数随访患者的Ig G抗体持续超过3年,提示患者如再次暴露于SFTSV,已有的免疫水平可提供保护,防止其再次感染SFTSV。同时,在未来开发出可用的SFTSV疫苗后,该研究结果可对疫苗的使用策略提供有效的参考。(3)初始病毒载量偏高或免疫系统受损的患者,例如有基础疾病史的高龄患者,固有免疫严重抑制,其启动适应性免疫时间延长,导致病毒的清除迟缓。基于此研究,认为SFTSV可通过操纵和攻击启动抗病毒反应的细胞,弱化宿主免疫应答,抑制患者的细胞和体液免疫反应,从而导致临床症状加重。