铂类抗癌药物因其抗癌谱广,疗效显著而被临床广泛使用。然而,在临床应用过程中发现铂类药物严重的毒副作用及耐药问题很大程度上限制了其在临床应用。为克服铂类药物存在的缺陷并提高铂类药物的疗效,大量新型铂类配合物被设计合成。除与顺铂类似的Pt（Ⅱ）配合物外,近年来作为前药的Pt（Ⅳ）配合物也被广泛研究。目前,已经合成多种Pt（Ⅳ）候选药物,旨在提高铂类药物的抑癌效力并且改善铂类药物的耐药性。本课题组长期致力于萘酰亚胺杂环化合物的合成及其作用机制研究,并取得丰硕成果。萘酰亚胺杂环化合物除可作为分子探针检测药物在亚细胞器中的分布外,最新研究表明多种Nap/Nal（萘酰亚胺/萘内酰胺）复合多胺类似物可同时通过肿瘤细胞高表达的多胺转运体（PTs,Polyamine Transporters）靶向肿瘤细胞,通过调控肿瘤多胺微环境、亚细胞器功能、逆转DNA损伤修复及增强肿瘤周围免疫作用表现出抗肿瘤生长及转移活性。研究表明,HMGB1是导致顺铂耐药的关键蛋白,并且HMGB1蛋白介导的自噬现象与多药耐药、细胞生长和迁移都密切相关,抑制HMGB1的胞浆转位可以调控溶酶体关键蛋白p62/LC3II/LC3I,并通过MEK/ERK信号通路抑制PI3K-Beclin 1复合物的形成。我们前期的研究结果表明,5μM Pt（Ⅳ）-Nap配合物可选择性定位于肿瘤细胞的溶酶体,表现对肿瘤细胞亚细胞器的靶向作用。新型Pt（Ⅳ）-Nap配合物是否可以通过调控高多胺微环境靶向肿瘤溶酶体抑制其自噬信号系统,并由HMGB1介导p62/LC3II/LC3I及MEK/ERK信号通路抑制PI3K-Beclin 1复合物的形成,从而选择性抑制肿瘤细胞溶酶体功能发挥抗肿瘤生长及迁移的作用?将是本课题研究的重点。实验方法:首次设计并合成不对称功能取代Pt（Ⅳ）-萘酰亚胺配合物和对称功能取代Pt（Ⅳ）-萘酰亚胺配合物以及多胺和糖修饰的萘酰亚胺衍生物;采用MTT法对目标化合物进行体外抑制癌细胞活性评价并筛选先导化合物;采用ICP-MS检测药物摄入量及与DNA结合的铂含量,评价其对肿瘤细胞及DNA的损伤程度;采用紫外可见分光光度计测定Pt（Ⅳ）-萘酰亚胺配合物先导的最大激发及发射波长;采用荧光分光光度计测定Pt（Ⅳ）-萘酰亚胺配合物先导在激发和发射波长激发下荧光强度的变化,初步估计其在共聚焦上的荧光范围;采用荧光倒置显微镜及徕卡激光共聚焦显微镜测定Pt（Ⅳ）-萘酰亚胺配合物先导在最大的激发及发射波长下在亚细胞器中的定位;采用亚细胞器分离技术进一步分离Pt（Ⅳ）-萘酰亚胺配合物先导所定位亚细胞器,分别采用流式、共聚焦及HPLC技术测定Pt（Ⅳ）-Nap先导合物与亚细胞器的相互作用。采用免疫印迹、定量q RT-PCR、免疫沉淀检测并分析Pt（Ⅳ）-萘酰亚胺配合物先导作用于肿瘤细胞中HMGB1/p62/LC3II/LC3I、MEK/ERK、PI3K-Beclin 1复合物表达情况的相关性、检测分析Pt（Ⅳ）-萘酰亚胺配合物先导对核蛋白磷酸化phospho-histone H2A-X（Ser139）及RAD51蛋白表达的影响来判断Pt（Ⅳ）-萘酰亚胺配合物先导对DNA损伤程度及逆转DNA损伤修复的程度、检测分析Pt（Ⅳ）-萘酰亚胺配合物先导对β-catenin蛋白的影响来判断细胞内部迁移蛋白的表达情况、检测先导化合物对p53蛋白的影响来判断细胞凋亡蛋白的表达情况;采用5’-GMP作为DNA模型研究Pt（Ⅳ）-萘酰亚胺配合物先导还原能力以及其与DNA结合能力;采用Transwell实验体外检测Pt（Ⅳ）-萘酰亚胺配合物先导体外抗肿瘤转移性;采用急性毒性实验计算先导化合物的治疗指数（TI值）;基于小鼠腋下移植实体瘤模型,评价先导化合物体内抗肿瘤生长活性;构建小鼠尾静脉注射移植瘤（肺转移）模型,评价先导化合物体内抗肿瘤转移性。实验结果:不对称功能取代Pt（Ⅳ）-萘酰亚胺配合物本系列一共设计合成9个不对称功能取代Pt（Ⅳ）-萘酰亚胺配合物。其中化合物Z1-Z8,Z13是在Pt（Ⅳ）伸出的两个羟基的一端引入棕榈酸脂,另外一端的羟基和萘酰亚胺上的羧基进行酯化得的到不对称功能取代的Pt（Ⅳ）-萘酰亚胺配合物。所有化合物均经过~1H NMR,13C NMR,ESI-MS和元素分析等手段进行结构表征验证。体内外活性实验:Z1-Z8,Z13不对称功能Pt（Ⅳ）-萘酰亚胺配合物的抗癌活性均优于阳性药顺铂和奥沙利铂,并且在耐药系数RF（0.05-0.27）,有明显对耐药细胞的选择性,有望克服顺铂耐药。化合物Z2在多种类型的癌细胞中表现出同阳性药顺铂和奥沙利铂一样的功效,Z13在多种癌细胞中表现出比阳性药更强大的杀伤作用,其IC50达到了纳摩级别。Transwell实验证明,先导化合物Z13可在体外抑制结直肠癌细胞的迁移。在体内实体瘤实验中,Z2和Z13可以有效抑制原位肿瘤的生长,Z2（12 mg/kg）组与Z13（12 mg/kg）的抑制率分别为62.5%和84.33%,明显高于顺铂（57.06%）和奥沙利铂（54.22%）。我们做了Z2和Z13与5-FU的FOLFOX联合用药治疗小鼠结直肠癌原位生长,其对肿瘤的抑制率达到了Z2+5-FU（81.00%）和Z13+5-FU（94.26%）,在小鼠体内肺转移实验中,Z2,Z13在小鼠体内抗转移活性也十分的突出,Z2（12 mg/kg）组与Z13（12 mg/kg）的抑制率分别为82.26%和88.12%,Z2和Z13与5-FU的FOLFOX联合用药治疗小鼠结直肠肺转移扩散实验中,其对肿瘤扩散的抑制率达到了Z2+5-FU（86.87%）和Z13+5-FU（92.70%）,与顺铂组和奥沙利铂组相比,Z2,Z13在体内的抗转移活性显著提高。作用机制研究:（1）通过激光共聚焦显微镜拍摄Z2,Z13作用于顺铂耐药肺腺癌A549cis R细胞中的作用靶标,我们发现Z2,Z13主要在溶酶体中聚集。（2）采用亚细胞器分离技术进一步分离Pt（Ⅳ）-萘酰亚胺配合物先导所定位亚细胞器,通过ICP-MS测药物在细胞中及亚细胞器中的摄取,我们发现溶酶体有大部分的金属铂存在。这也就是说Z2,Z13可能改变了铂类药物作用的靶点。相对于阳性药顺铂和奥沙利铂,我们发现Z2和Z13在细胞中的铂摄取总量也是远远高于阳性药。（3）激光共聚焦显微镜监测配体G2的在细胞中的定位情况显示,G2作用部位在溶酶体;但是MTT结果显示,G2单独使用对癌细胞没有抑制作用。这就说明,进去溶酶体部分的Z2,Z13在溶酶体中发挥疗效时是其整体结构的作用。（4）通过免疫印迹实验检测顺铂作用癌细胞中HMGB1/p62/LC3Ⅰ/LC3Ⅱ蛋白,发现细胞对顺铂产生耐药的原因可能是细胞中HMGB1介导的保护性自噬产生的。（5）通过免疫印迹实验检测Z13作用顺铂耐药肺腺癌A549cis R细胞中HMGB1/p62/LC3Ⅰ/LC3Ⅱ蛋白,Z13可以抑制HMGB1介导的保护性自噬蛋白p62的上调,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的下调,从而提高耐药细胞对化疗药物的敏感性促进细胞凋亡。（6）通过免疫印迹实验检测Pt（Ⅳ）-萘酰亚胺配合物先导Z13作用癌细胞后核蛋白磷酸化phospho-histone H2A-X（Ser139）表达情况显示,相比于阳性药物顺铂,Z13可以导致γ-H2AX（Ser139）的明显上调。（7）通过免疫印迹实验检测Pt（Ⅳ）-萘酰亚胺配合物先导Z13作用癌细胞后p53蛋白显著上调。（8）在加入HMGB1胞浆转位的药理学抑制剂EP后,Pt（Ⅳ）-萘酰亚胺配合物先导Z13显著诱导细胞凋亡。对称功能取代Pt（Ⅳ）-萘酰亚胺配合物本系列设计合成四个对称双功能取代的Pt（Ⅳ）-萘酰亚胺配合物,包括Z9,Z10,Z11,Z12四个目标化合物,所有化合物的结构均经过~1H NMR,13C NMR,ESI-MS和元素分析等结构表征技术的验证。体内外活性试验:此系列对称功能取代的Pt（Ⅳ）-萘酰亚胺配合物抑癌能力整体优于顺铂和奥沙利铂,Z9在所测试的三种七株癌细胞中的IC50值达到了纳摩水平,其耐药系数RF（0.59）明显低于阳性药物顺铂（4.01）和奥沙利铂（3.90）,有明显对顺铂耐药细胞的选择性。在体内乳腺癌实体瘤实验中,Z9可以有效抑制原位肿瘤的生长,Z9（12mg/kg）组抑制率为72.10%,明显高于阳性化疗药物顺铂（57.06%）和奥沙利铂（52.88%）。作用机制研究:（1）采用亚细胞器分离技术分离对称功能取代的Pt（IV）-萘酰亚胺配合物先导Z9作用于肺腺癌A549及顺铂耐药肺腺癌A549cis R的细胞核,通过ICP-MS测药物在细胞中及细胞核中的摄取,我们发现Z9在肺腺癌A549细胞与顺铂耐药肺腺癌的A549cis R细胞中细胞摄取及DNA结合水平明显优于阳性药物顺铂和奥沙利铂。（2）通过免疫印迹及定量q RT-PCR实验检测Z9作用于肺腺癌耐药细胞中p53蛋白和基因的表达情况显示,Z9可上调p53蛋白和基因的表达诱导细胞凋亡。（3）通过免疫印迹及定量q RT-PCR实验检测Z9作用于肺腺癌耐药细胞中核蛋白磷酸化phospho-histone H2A-X（Ser139）及其基因表达情况显示,相较于顺铂和奥沙利铂,Z9明显上调核蛋白磷酸化phospho-histone H2A-X（Ser139）及其基因的表达。（4）通过免疫印迹及定量q RT-PCR实验检测Z9作用于肺腺癌耐药细胞中RAD51及其基因表达情况显示,Z9可下调RAD51蛋白和基因的表达,逆转了DNA损伤修复,促进癌细胞的凋亡。（5）对Z9的还原能力及与DNA结合能力研究发现,Z9可通过还原性物质还原为Pt（Ⅱ）,并在细胞内与DNA结合,发挥抗癌特性。多胺和糖修饰的萘酰亚胺衍生物本部分设计合成两个系列的化合物,包括对萘酰亚胺的酰亚胺部位引入多胺链的修饰的L1-L11,以及用全乙酰化葡萄糖对氨萘菲特结构上氨基进行修饰的萘酰亚胺衍生物Y1,Y2。所有化合物的结构均经过~1H NMR,13C NMR,ESI-MS和元素分析等手段进行结构表征验证。体内外活性研究:本部分小分子化合物的抗癌活性不及上两个系列带金属铂的化合物,但是较比萘酰亚胺经典药物氨萘菲特的话,L11表现出良好的抗癌活性,尤其对于肝癌细胞来说,其IC50（3.31μM）优于阳性氨萘菲特的IC50（9.38μM）。对化合物L11进行了体内肝癌实体瘤实验,发现较比于阳性药氨萘菲特（5 mg/kg）的抑制率39.93%,L11（5 mg/kg）的抑制原位肿瘤生长的抑制率达到57.1%,明显抑制肝癌实体瘤原位生长。对于1位全乙酰化葡萄糖修饰氨萘菲特氨基结构的Y1和Y2,在所测试的三种不同类型的人癌细胞,明显比氨萘菲特降低了活性,值得注意的是化合物Y1对于肝癌细胞的抑制率有等同甚至优于氨萘菲特的效果。作用机制研究:（1）通过激光共聚焦显微镜拍摄L11作用于肝癌Hep G2细胞中的作用部位,我们发现L11被定位于溶酶体中。（2）通过免疫印迹实验检验萘酰亚胺多胺衍生物L11作用于肝癌Hep G2细胞中p53蛋白表达情况显示,L11可激活p53蛋白并上调其表达诱导细胞凋亡。（3）通过免疫印迹实验检测萘酰亚胺多胺衍生物L11作用肝癌Hep G2细胞中HMGB1/p62/LC3Ⅰ/LC3Ⅱ蛋白表达情况,L11可以上调自噬底物p62蛋白的表达;下调LC3Ⅱ/LC3Ⅰ;下调HMGB1蛋白的表达说明L11可以抑制Hep G2细胞发生自噬,而这种自噬可能与HMGB1相关。实验结论:Z13,一种能够克服顺铂耐药的不对称Pt（IV）-萘酰亚胺配合物Z13,可以有效抑制体内外肿瘤的生长,其体内抗转移活性也有明显抑制作用。机制研究表明:Z13能够靶向溶酶体,通过抑制顺铂耐药A549cis R细胞中HMGB1介导的保护性自噬进而提高耐药细胞对化疗药物的敏感性从而引发细胞凋亡。从实验结果来看,Z13抗肿瘤活性可能与引起细胞中的自噬变化有着密切的关系,对于Z13抗肿瘤生长及转移机制的研究还在进一步的探索。Z9,具有最小副作用的单硝基萘酰亚胺Pt（Ⅳ）配合物,通过双重脱氧核糖核酸损伤途径而靶向DNA损伤反应。潜在的分子机制表明Z9以与现有铂类药物完全不同的方式靶向耐药细胞。Z9的细胞积累和基因组DNA中的铂含量水平几乎是顺铂和奥沙利铂的5倍。Z9比顺铂更有效地促进了p53基因和蛋白质的表达,从而提高了抗癌活性。γH2A.X的上调和RAD51的下调表明Z9不仅引起严重的DNA损伤,而且抑制DNA损伤修复,因此与顺铂相比具有更高的细胞毒性。体内4T1细胞更高的治疗指数表明:Z9,萘二甲酰亚胺-Pt（Ⅳ）缀合物在乳腺癌的治疗中起着至关重要的作用。该研究暗示了铂类药物在全新领域中通过双重DNA损伤机制治疗靶向DNA损伤修复的耐药性癌症提供了重要策略。L11,一种新型萘酰亚胺多胺衍生物,在5 mg/kg的体内显示出显著提高的抗肿瘤生长的作用,潜在的分子机制研究表明,除了通过上调p53诱导细胞凋亡外,L11还靶向溶酶体,以完全不同于氨萘菲特的方式调节多胺代谢和功能。此外,HMGB1/p62/LC3Ⅱ/LC3Ⅰ通路参与L11抑制肝癌的生长。该研究表明萘酰亚胺多胺缀合物通过靶向自噬来治疗肝癌是一种有前途的策略,具有降低的毒性和显著的活性。