细菌体内表达基因的研究是近年来研究者关注的热点之一,国内外一些研究者已经报道通过IVET、STM、微阵列等实验技术来筛选鉴定细菌体内表达基因;但是关于猪源多杀性巴氏杆菌体内表达基因的筛选鉴定国内外尚未见报道。本实验以国外报道禽源多杀性巴氏杆菌体内表达基因为研究依据,通过构建猪源多杀性巴氏杆菌动物体内感染模型,使用RT-PCR技术,成功筛选鉴定出两个体内表达基因pm1069和pm0221,并进行了克隆测序分析,分别构建了原核表达载体pET-32a(+)-pm1069、pET-32a(+)-pm0221;并初步对基因pm1069进行了原核表达和免疫研究,研究结果如下:本研究采用猪源多杀性巴氏杆菌标准强毒株为实验对象,以国外报道的14个禽源多杀性巴氏杆菌体内表达基因为依据,设计14对相关基因的引物,通过建立猪源多杀性巴氏杆菌动物体内感染模型,并以猪源多杀性巴氏杆菌体外培养为对照;分别提取体内培养和体外培养细菌的RNA,经过DNA酶的处理,经过RT-PCR和琼脂糖凝胶电泳分析,初步筛选鉴定出基因pm1069和pm0221为体内表达基因,即它们在动物体内环境下能够表达,而在体外环境培养下不能够表达。在筛选的基础上,以猪源多杀性巴氏杆菌基因组DNA为模板,克隆出基因pm1069和pm0221的全序列,并对其进行测序分析,与NCBI上GenBank公布的禽源多杀性巴氏杆菌pm70的pm1069和pm0221基因进行序列比较,其同源性分别达到94.8%和98.8%。经过相关生物信息学软件分析,对其抗原性强的区域进行了克隆,并构建了原核重组表达载体pET-32a(+)-pm1069和pET-32a(+)-pm0221。选用原核重组表达载体pET-32a(+)-pm1069,转化Rosetta大肠杆菌表达菌株,经过表达条件的优化,在培养温度为30度,IPTG为0.4mg/ml,诱导时间为4小时的条件下,成功表达出大小约63.0KD的pm1069目的融合蛋白;该蛋白主要是以包涵体形式存在,纯化浓缩后的蛋白浓度大约3.0mg/ml。纯化的目的蛋白,免疫健康公兔,制备抗血清。运用方阵滴定,间接ELISA筛选出最佳抗原包被浓度为1:400(约7.5ug/ml目的蛋白)和最佳抗血清稀释倍数为1:1600。对目的蛋白进行Western-Blot检测,其具有大小约为63.0KD的目的印迹条带,说明该蛋白具有抗原性。以最佳抗原包被浓度1:400包被pm1069重组表达蛋白,将随机选取的20只健康家兔阴性血清按照最佳稀释倍数1:1600进行稀释;用建立的间接ELISA方法对其进行测定OD450值,求得20份阴性血清OD450值的平均值X大小为0.072,标准差S大小为0.006,按照X+3S大小为0.090,作为间接ELISA检测体内表达产物抗体判定结果为阳性的临界值,建立了检测猪源Pm菌小鼠体内表达产物抗体的间接ELISA方法;运用此方法,对猪源Pm活菌苗和死菌苗分别免疫小鼠所产生的抗体进行了检测,结果表明活菌苗组产生的抗体0D450值均明显≥0.090,结果判定为阳性;而死菌苗组产生的抗体均＜0.090,该方法能够对猪源Pm菌感染和死菌免疫小鼠所产生的抗体进行区分。目前,对猪源多杀性巴氏杆菌体内表达基因的筛选鉴定及其研究的报道国内外还未见报道,本研究为建立区分猪源多杀性巴氏杆菌感染和免疫的方法打下了一定基础。