论文部分内容阅读
本研究以两个苹果砧木的杂交组合实生后代为试验材料,利用SRAP和SSR标记技术,结合BSA法,对耐盐不同的材料进行了鉴定及耐盐性相关基因的差异表达分析。主要研究结果如下:1.确定了适于分子标记的苹果基因组DNA的提取方法(改良CTAB法),其提取液成分为:基本提取液(100mmol/L Tris-HCl,20mmol/L EDTA,1.4mol/L NaCl,2%CTAB)中添加1%PVP40、10mmol/L Na2S2O5和1%β-巯基乙醇等防酚抗氧化物质,提取中加入高盐可去除多糖。粗提后的DNA经RNase酶除去RNA,氯仿/异戊醇抽提,无水乙醇沉淀,得到了RNA去除彻底、纯度高、质量好的苹果基因组DNA。2.确立了苹果砧木SRAP反应体系:15μL体系中,包括基因组DNA60ng,10×PCR Buffer(with Mg2+)1.5μL,dNTP 0.3mmol·L-1,引物50ng,Taq聚合酶0.75U。3.确立了苹果砧木SSR反应体系:15μL体系中,包括基因组DNA 60ng,10×PCR Buffer(with Mg2+)1.5μL,dNTP 0.25mmol·L-1,引物0.33μmol·L-1,Taq聚合酶1.0U。4. 128对SRAP引物57对引物在亲本间表现出多态性,其中有4对引物(Me1Em2、Me1Em8、Me1Em12和Me1Em14)在DNA池中表现出多态性,共产生多态性带4条。此4种标记在低耐盐组和高耐盐组间表现多态性,对所有杂交后代单株进行验证,结果显示:144个杂交后代中,表现低耐盐的96个单株中分别有15株、18株、16株和11株发生了交换;表现高耐盐的48个单株中分别有4株、8株、5株和0株发生了交换,在多态性位点未出现特异性片段。结果表明,所筛选到的标记可用于砧木耐盐性鉴定。5. 79对SSR引物中有3对引物(P61、P63和P64)在亲本和DNA池中表现出多态性,共产生多态性带10条。此3种标记在低耐盐组和高耐盐组间表现多态性,对所有杂交后代单株进行验证,结果显示:144个杂交后代中,表现低耐盐的96个单株中分别有13株、15株和8株发生了交换;表现高耐盐的48个单株中分别有2株、5株和8株发生了交换。结果表明,所筛选到的标记可用于砧木耐盐性鉴定。6.对得到的差异片段进行回收、测序,通过BLAST和其它植物比对,发现Ⅰ号序列与一条编码ATP合酶β亚基(ATP-B)基因和一条水分亏缺胁迫cDNA克隆基因EST的同源性非常高,该序列编码涉及到了抗性表达、离子转运基因,可能参与了植物抗性表达,说明获得的基因序列应是与苹果砧木抗性相关的基因;Ⅱ序列与一条serine/threonine kinase(丝氨酸/苏氨酸激酶)蛋白激酶的蛋白序列同源性比较高,核酸比对较低,可能是具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶功能的新基因。A1、A2序列与一条编码ATP合酶β亚基(ATP-B)基因的同源性较高。