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背景:转移是导致原发性肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)预后不良的重要因素之一。尽管血道转移占到了转移患者的64%,但在未发生血道转移的早期,33.8%的HCC就发生了肝外淋巴道转移,因此淋巴道转移是HCC另一重要的转移通道。研究HCC淋巴道转移机制并探索有效的精准靶向具有重要的现实意义。膜联蛋白A7(Annexin A7,Anxa7)是一种钙依赖磷脂结合蛋白,既往文献报道Anxa7在肝癌淋巴道转移中发挥着重要作用。对淋巴道转移率不同的鼠肝癌细胞系进行体外实验证明,在两株细胞系之间Anxa7表达具有差异性,高转移率细胞系中Anxa7表达较高,提示Anxa7能够促进肝癌淋巴道转移。但也有观点认为Anxa7能够对肝癌淋巴道转移起到抑制作用,分别上调与下调鼠肝癌细胞系Hca-P中Anxa7的表达,并将处理后的细胞接种于小鼠足垫,统计小鼠淋巴结转移率,发现上调Anxa7表达后淋巴结转移率下降,这一结果说明Anxa7抑制了淋巴道转移。目前,对Anxa7在HCC中发挥的作用仍有争议,确切的机制也并不清楚。在淋巴道转移研究中,VEGF-C/D/R3信号轴是目前为止发现的最关键的淋巴管生成调控通路,该通路在包括HCC在内的多种肿瘤中具有促进淋巴道转移的作用。肿瘤细胞及肿瘤相关间质细胞产生的VEGF-C/D通过与淋巴管内皮细胞上的受体VEGFR-3特异性结合,引起受体磷酸化,调节淋巴管内皮细胞增殖、迁移,诱导淋巴管的生成,最终引起淋巴道转移的发生。我们预测Anxa7可能是通过参与VEGF-C/D/R3通路调控了HCC淋巴道转移。目的:1、探讨Anxa7、VEGF-C/D的表达在HCC发生发展及淋巴道转移中发挥的作用;2、探讨Anxa7表达与VEGF-C/D/淋巴管内皮VEGFR-3的调控关系及对淋巴管生成的影响。方法:1、收集20例HCC患者的肿瘤组织及配对正常肝组织,采用real time PCR与Western blot的方法检测瘤组织及配对组织中Anxa7、VEGF-C/D的表达情况;2、通过免疫组化方法检测160例HCC中Anxa7、VEGF-C/D表达,探究Anxa7、VEGF-C/D表达与临床病理因素及患者预后生存期的关系,D2-40染色计数微淋巴管密度;3、选择人肝细胞系THLE-2、VEGF-C/D正常表达人肝癌细胞系Hep G2及VEGF-C/D弱表达人肝癌细胞系SK-Hep-1,依据是否添加重组蛋白培养将THLE-2、Hep G2及SK-Hep-1细胞分为处理组与未处理组,处理组使用人Anxa7重组蛋白上调Anxa7表达,未处理组在细胞培养过程中不添加重组蛋白,采用real time PCR、Western blot及ELISA的方法检测两组细胞中Anxa7、VEGF-C/D的表达及分泌情况;4、将两组细胞分别与淋巴管内皮细胞HDLEC进行共培养成管实验,计数下室细胞成管数目,real time PCR与Western blot的方法检测HDLEC细胞中VEGFR-3表达水平;5、使用免疫共沉淀的方法对Anxa7与VEGF-C之间的相互作用进行探究。结果:1、对肝癌组织与配对正常组织中Anxa7、VEGF-C/D在基因水平及蛋白水平的表达进行比较分析。我们发现在基因水平,肿瘤组织中Anxa7与VEGF-C的表达高于正常组织(P=0.006,0.027),VEGF-D表达则没有明显差异(P=0.167);在蛋白水平,Anxa7与VEGF-C在瘤组织中的表达同样大于配对正常组织(P=0.047,0.04),VEGF-D在两者间的表达则没有差异(P=0.64)。比较淋巴结转移组与未转移组Anxa7、VEGF-C/D的差异性,发现Anxa7基因与VEGF-C基因的表达在转移组更高(P=0.01,0.01),VEGF-D基因的表达则没有明显差异(P=0.186);在蛋白水平,Anxa7与VEGF-C的表达在转移组高于未转移组(P=0.02,0.01),而VEGF-D蛋白的表达在两组间没有明显差别(P=0.56);2、对LMVD值进行比较分析,显示瘤内组织LMVD值明显高于瘤旁(P=0.01);对比转移组与未转移组LMVD值,瘤内组织LMVD值在两组间具有显著差异(P=0.01)而瘤旁组织LMVD值(P=0.26)则没有明显差异。在对VEGF-C/D表达与瘤内LMVD相关性进行探究时,我们发现VEGF-C基因的表达与瘤内LMVD具有正相关性(P=0.00),VEGF-D基因则没有相关性(P=0.348);VEGF-C蛋白的表达与瘤内LMVD同样具有正相关性(P=0.04),而VEGF-D蛋白的表达与瘤内LMVD则没有明显的相关性(P=0.85);3、为了探讨Anxa7与VEGF-C/D/R3信号轴及瘤内LMVD的关系,我们分析了Anxa7的表达与VEGF-C/D及瘤内LMVD的相关性,发现Anxa7基因的表达与VEGF-C基因表达及瘤内LMVD有正相关性(P=0.00,0.00),与VEGF-D基因的表达则没有明显相关性(P=0.638);Anxa7蛋白的表达与VEGF-C蛋白表达、瘤内LMVD同样具有正相关性(P=0.00,0.00),与VEGF-D则没有明显相关性(P=0.92);4、免疫组化结果显示,Anxa7、VEGF-C及VEGF-D定位于肿瘤细胞及正常肝细胞细胞质,肿瘤组织中Anxa7、VEGF-C染色强度强于正常肝组织而VEGF-D在肝癌组织与正常肝组织间差异不明显;Anxa7、VEGF-C在淋巴结转移组中的表达强于未转移组,VEGF-D表达在两组间差异不明显。Spearman相关性检验显示Anxa7及VEGF-C表达与肝细胞肝癌的分化程度呈负相关,与肿瘤大小、TNM分级、淋巴结转移呈正相关,生存分析显示Anxa7与VEGF-C高表达患者5年生存率较低,HCC中Anxa7与VEGF-C表达是影响患者预后的独立影响因素;5、对比处理组与未处理组THLE-2、Hep G2、SK-Hep-1细胞中VEGF-C/D表达与分泌情况及共培养淋巴管内皮细胞HDLEC、血管内皮细胞HUVEC中VEGFR-3的表达情况,结果显示,上调Anxa7表达后,THLE-2、Hep G2、SK-Hep-1中VEGF-C的表达在基因水平与蛋白水平均显著增加,细胞培养液中VEGF-C分泌量也明显增加,而VEGF-D表达及分泌均无明显变化。而共培养HDLEC细胞中,无论在基因水平还是蛋白水平,VEGFR-3的表达上升;HUVEC中VEGFR-3表达未发生明显变化。6、成管实验显示,添加重组蛋白上调上室THLE-2、Hep G2、SK-Hep-1细胞中Anxa7表达后,下室共培养HDLEC细胞成管数目明显增加,而HUVEC细胞成管数目并未发生明显变化。7、免疫共沉淀实验证明Anxa7与VEGF-C间无相互作用。结论:1、Anxa7与VEGF-C具有促进HCC发生发展以及淋巴道转移的作用,是影响HCC患者预后的独立影响因素;2、Anxa7能够上调VEGF-C表达及分泌,促进淋巴管内皮细胞VEGFR-3表达,增加瘤内淋巴管的生成从而促进了HCC的淋巴道转移。