细菌性病害是影响水产动物健康养殖业发展的主要因素，人们迫切需要一种快速、稳定、准确、高通量的检测手段，对疾病进行提前预警及诊断。随着基因芯片技术的快速发展及微生物基础信息数据库的日渐完善，将基因芯片技术应用于水产病原菌的检测及海水养殖动物疾病的诊断，是一种需要也是一种发展趋势，这将更加有力于海水养殖业的健康、可持续发展。　　 本论文根据蓝皮书、国际兽疫局(OlE)水生动物疾病名录、亚太水产养殖中心网络(NACA)水生动物疾病名录等，选择海水养殖鲽形目鱼类、鲈形目鱼类、对虾类和双壳贝类等宿主的主要病原性原核微生物：鳗弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌、副溶血弧菌、哈维氏弧菌、杀鲑弧菌、河流弧菌、霍乱弧菌（非o1型）、链球菌、爱德华氏菌、嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、杀鲑气单胞菌、假单胞菌、鲑鱼肾杆菌等作为研究对象，另外又加入费氏弧菌、灿烂弧菌、拟态弧菌、海洋分枝杆菌等四种细菌。针对这些研究对象，利用中外文学数据库资源，检索相关研究性文献，从中汇总出用于病原菌检测的特征基因（管家基因、毒力相关基因等特征基因）308个。从GenBank中检索并存档这些特征基因的部分序列3591条，包括质控系统所需基因的部分序列116条。　　 利用GenBank中在线序列同源性检索工具BLAST，对存档的序列进行检索比对，初步筛选后再经过生物信息学专业分析软件Omiga2.0或Accelrys gene2.5对序列进行多重比对，筛选出各种病原菌每个基因对应核酸信息的保守序列或特异序列，将筛选的代表序列或片段再次进行BLAST回检，最终确定代表序列。将代表序列同时导入到微阵列专业设计软件AlleleID6.0中，根据引物和探针的设计原则，在同一个任务下批量设计出退火温度、序列长度等参数一致的引物，扩增片段长度为200～600bp。截取各个参数相对好及BLAST回检结果较理想的引物的扩增序列，同时导入AlleleID6.0中，同一任务下设计出57bp的寡核苷酸探针。探针同样经过BLAST回检，并确保探针间以及与引物间没有交叉，交由生物工程（上海）有限公司合成，引物5端标记HEX，探针3端进行氨基修饰。　　 根据本实验室内保留、分离鉴定的9种海水养殖动物病原菌，分别为鳗弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、哈维氏弧菌(04081801)、费氏弧菌、灿烂弧菌、嗜水气单胞菌、迟缓爱德华氏菌、杀鲑气单胞菌(06112506)，筛选出15对特征基因引物和对应的15条特异性寡核苷酸探针，筛选出细菌16S通用引物16-2引物及对应探针作为杂交阳性内对照，筛选牛的胸腺素a原基因ProTa引物及对应探针作为杂交阳性外对照，筛选拟南芥TCP10基因的探针作为阴性对照，选择WSSVvariable region带有荧光标记的一段序列作为表面化学质控，构建出病原菌共检基因芯片。　　 以病原菌基因组DNA为模板，用15对特征基因引物进行PCR扩增，结果除了V.an-3有非特异性扩增、V.al-1与V.p-1有交叉反应外，其余引物都成功地扩增出了靶序列；同时用9种病原菌基因组DNA及中国明对虾、凡纳滨对虾、斑节对虾、斑马鱼、大菱鲆基因组DNA为模板，验证了质控系统中的阳性内、外对照基因引物的特异性。利用博奥生物有限公司生产的醛基基片，点制出质控系统及病原微生物特征基因的探针微阵列，将标记有HEX的PCR产物与芯片进行杂交。结果验证了检测基因芯片上除V.h-2-P57、V.al-2-P57外的19条寡核苷酸探针的杂交特异性，包括4条质控系统的探针，可以实现对8种病原菌：鳗弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、费氏弧菌、灿烂弧菌、嗜水气单胞菌、迟缓爱德华氏菌、杀鲑气单胞菌(06112506)的特异性检测，及初步的毒力判定。　　 在已经设计有部分海水养殖动物病原菌特征基因的引物及探针的基础上，建立并优化了可同时检测海水中常见的三种属的代表菌株鳗弧菌、嗜水气单胞菌、迟缓爱德华氏菌的多重PCR检测方法。与基因芯片连用，构建可同时、平行检测三种病原菌的多重PCR-基因芯片技术，并用分离于患病大菱鲆体内的病原菌进行验证，结果表明该患病大菱鲆感染有鳗弧菌，此结果也与细菌16S rRNA通用引物扩增的产物测序结果相符。　　 在基因芯片样品的PCR产物扩增上，本文设计了一种新技术并对此进行了初步的探索，力求同时、平行扩增出多种基因的PCR产物，并且大大降低引物的标记费用。首先设计出带有公用接头的引物NO1-V.an-1及公用引物NO2，验证NO2不与任何模板有扩增反应；再对相应的PCR扩增程序及其他反应条件进行了探索及优化，初步形成了一种类似于巢式PCR的由公用引物接头引导的两步PCR扩增技术。利用鳗弧菌特征基因的两对引物进行的由公用引物接头引导的、两步二重-PCR技术的扩增结果，也显示出它在多种基因同步PCR扩增中的优势，可以大大降低基因芯片中标记靶序列的费用，有利于基因芯片技术的普及与应用。　　 本文在最后就基因芯片检测技术在海水养殖疾病诊断中的应用情况，做出了分析及展望。相信将该项技术应用于海水养殖动物病原微生物的检测，可以起到切实、有效的预警和诊断作用，可以保障海水养殖业的健康、可持续的发展。