论文部分内容阅读
研究表明胎盘的正常发育与胎盘内氧分压变化密切相关,妊娠8～10周胎盘处于缺氧环境,10周后氧分压升高,这种氧分压变化可影响滋养细胞增殖、侵袭能力,进而影响胎盘的发育。胎盘发育不良可引起多种妊娠相关疾病发生,例如:子痫前期等。子痫前期(preeclampsia,PE)是妊娠期特有的疾病之一,目前世界范围内发病率为5%～10%,以妊娠20周后新发的高血压、水肿、蛋白尿为主要特征,是影响产妇和围产儿发病及死亡的主要原因。但是子痫前期具体的发病机制尚不清楚,目前被广泛认可的是滋养细胞侵袭能力不足,引起螺旋动脉重铸障碍和胎盘浅着床,导致胎盘持续缺血缺氧和发育障碍。缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1 alpha,HIF-1α)是细胞应对低氧环境的一个关键转录因子,可激活下游靶基因转录,调节细胞增殖、侵袭、凋亡等多方面能力。研究表明HIF-1α与子痫前期发生发展密切相关,在子痫前期孕妇的胎盘组织和血清中发现HIF-1α表达升高;在细胞实验中发现HIF-1α的表达可影响滋养细胞侵袭和凋亡能力。叉头框转录因子3a(forkhead box protein O 3a FOXO3a)是叉头框蛋白O家族的成员之一,也是一个关键的转录因子,可以调节细胞代谢、细胞周期等生物学过程以及缺氧、氧化应激、热休克等多种应激反应。FOXO3a在前列腺癌和乳腺癌等多种癌症中表达下调,可抑制癌症的发生发展,其表达与多种癌症的预后不良有关,被认为是癌症诊断和治疗的新靶点。研究发现FOXO3a是HIF-1α介导细胞应激感应的关键下游分子,缺氧处理脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)和心肌微血管内皮细胞(cardiac microvascular endothelial cells,CMECs)发现HIF-1α可以促进FOXO3a的表达,并且影响细胞凋亡能力。但是缺氧条件下HIF-1α调节FOXO3a对滋养细胞生物学功能的影响尚未见报道。目的以胎盘组织和人早孕绒毛外滋养细胞系HTR8-SVneo细胞为研究对象,探究缺氧条件下HIF-1α对滋养细胞FOXO3a的表达及细胞侵袭和凋亡能力的影响,进一步探究其在子痫前期发生发展中的作用。材料和方法1研究对象胎盘组织选取2017年5月到2018年10月在郑州大学第三附属医院剖宫产分娩的早发子痫前期孕妇(PE组)和健康足月孕妇(对照组)的胎盘组织各30例。早发子痫前期的诊断标准参考人民卫生出版社出版的第8版《妇产科学》教材。HTR8-SVneo细胞株购自美国ATCC公司,此细胞株来自人早孕绒毛外滋养细胞。本研究选择胎盘组织和HTR8-SVneo细胞为研究对象。研究选取的组织标本经过郑州大学第三附属医院伦理委员会批准,病人均知情同意,并签署知情同意书。2方法2.1 FOXO3a在胎盘组织中的表达采用实时荧光定量 PCR(Real-time Quantitative PCR,qRT-PCR)和 Western blot法检测胎盘组织中FOXO3a mRNA及蛋白的表达;采用免疫组化法检测FOXO3a蛋白在胎盘组织滋养细胞中的表达和定位。2.2建立细胞缺氧模型采用浓度分别为 0、125、250、500μmol/L 的氯化钴(cobaltchloride,CoCl2)分别处理HTR8-SVneo细胞24h、48h、72h,采用CCK8法检测细胞活力,选择细胞活力抑制率在50%(IC50)的药物处理浓度和时间,即实验选取250μmol/LCoCl2预处理48h的HTR8-SVneo细胞作为细胞缺氧模型,并进行后续试验。2.3氯化钴处理HTR8-SVneo细胞后HIF-1α和FOXO3a蛋白表达采用浓度分别为0、125、250、500μmol/L的CoCl2分别处理HTR8-SVneo细胞48h,采用Western blot法检测HIF-1α和FOXO3a蛋白的表达水平。使用浓度为 250μmol/L 的 CoCl2 分别处理 HTR8-SVneo 细胞 Oh、24h、48h、72h,采用Western blot法检测HIF-1α和FOXO3a蛋白的表达水平。2.4缺氧条件下沉默FOXO3a对HTR8-SVneo细胞侵袭和凋亡能力的影响将HTR8-SVneo细胞分为4组:常氧组、缺氧组、缺氧NC组和缺氧siFOXO3a组,利用细胞转染技术分别将NC siRNA转入缺氧NC组,将FOXO3asiRNA转入缺氧siFOXO3a组,再利用氯化钴分别对缺氧组、缺氧NC组和缺氧siFOXO3a组进行缺氧处理48h,常氧组不进行任何处理,采用qRT-PCR和Western blot法检测各组FOXO3amRNA及其蛋白的表达水平;采用Transwell试验检测细胞的侵袭能力;采用流式细胞术检测细胞的凋亡能力。2.5缺氧条件下沉默HIF-1α对HTR8-SVneo细胞侵袭和凋亡的能力影响将HTR8-SVneo细胞分为4组:常氧组、缺氧组、缺氧NC组和缺氧siHIF-1α组,利用细胞转染技术分别将NC siRNA转入缺氧NC组,将HIF-1α siRNA转入缺氧siHIF-1α组,再利用氯化钴分别对缺氧组、缺氧NC组和缺氧siHIF-1α组进行缺氧处理48h,常氧组不进行任何处理,采用qRT-PCR检测各组HIF-1αmRNA的表达水平;采用Western blot分别检测各组HIF-1α和FOXO3a蛋白的表达水平;采用Transwell试验检测细胞的侵袭能力;采用流式细胞术检测细胞的凋亡能力。3统计学处理数据均采用GraphPad Prism 7.0软件进行统计分析,数据以(?)方式表示。两组数据分析使用独立样本t检验,多组数据分析使用单因素方差分析,两两比较采用Bonferroni检验,以α=0.05作为检验水准。结果1两组孕妇一般临床资料和胎盘组织FOXO3a的表达情况1.1两组孕妇一般临床资料的比较对照组和PE组孕妇的平均年龄分别是(32.45±4.66)岁和(32.90±5.41)岁,剖宫产分娩时的平均孕周分别是(39.00±0.50)周和(32.43±1.59)周,收缩压分别是(114.72±7.26)mmHg和(162.29±13.79)mmHg,舒张压分别是(72.52±8.22)mmHg 和(102.81±9.53)mmHg,尿蛋白分别是(0.08±0.04)g/24h 和(4.99±2.96)g/24h,新生儿体重分别是(3518.28±350.87)g 和(1457.74±376.13)g。两组孕妇在分娩年龄上,差异无统计学意义;但是PE组在收缩压、舒张压和尿蛋白含量方面均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);在孕周和新生儿体重方面低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。1.2两组孕妇胎盘组织中FOXO3amRNA及其蛋白的表达PE组FOXO3amRNA和蛋白的表达水平(2.33±0.99,1.29±0.43)高于对照组(0.89±0.28,0.25±0.18),差异有统计学意义(P<0.05)。1.3两组孕妇胎盘组织中FOXO3a蛋白的表达及定位FOXO3a蛋白在胎盘组织中合体滋养细胞、细胞滋养细胞及绒毛外滋养细胞的胞质和胞核中均有表达,且PE组(4.62±2.29)染色强度高于对照组(1.45±1.30),差异有统计学意义(P<0.05)。2缺氧条件下HTR8-SVneo细胞活力的比较及细胞中HIF-1 α和FOXO3a蛋白的表达2.1氯化钴处理HTR8-SVneo细胞后各组细胞活力的变化氯化钴处理24h细胞活力:125μmol/L组(1.08±0.08)细胞活力高于0 μmol/L组(0.86±0.12),而 500 μmol/L 组(0.60±0.09)细胞活力低于 0 μmol/L 组(0.86±0.12),差异有统计学意义(P<0.05)。氯化钴处理48h细胞活力:250μmol/L组(0.52±0.10)和 500μmol/L(0.33±0.08)组细胞活力均低于 0 μmol/L组(1.07±0.18),差异有统计学意义(P<0.05)。氯化钴处理72h细胞活力:125μmol/L组(0.81±0.09)、250μmol/L 组(0.38±0.08)和 500μmol/L 组(0.22±0.07)细胞活力均低于0μmol/L组(1.12±0.12),差异有统计学意义(P<0.05)。2.2不同浓度的氯化钴处理HTR8-SVneo细胞HIF-1α和FOXO3a蛋白的表达125μmol/L组(0.99±0.15,0.67± 0.07)、250μmol/L 组(1.15±0.11,0.94±0.16)和 500μmol/L 组(0.63±0.08,1.18±0.17)HIF-1α 和 FOXO3a 蛋白表达均高于 0μmol/L 组(0.41±0.05,0.37±0.06),差异有统计学意义(P<0.05)。2.3 250μmol/L氯化钴处理HTR8-SVneo细胞不同时间HIF-1α和FOXO3a蛋白的表达24h 组(1.11±0.15,0.85±0.08),48h 组(1.21±0.14,1.24±0.16),72h 组(1.51±0.14,1.48±0.13)HIF-1α 和 FOXO3a 蛋白表达均高于 Oh 组(0.43 ±0.10,0.42±0.10),差异有统计学意义(p<0.05)。3缺氧条件下沉默FOXO3a后HTR8-SVneo细胞中FOXO3a mRNA及其蛋白的表达常氧组(0.99±0.11,0.33±0.04)、缺氧组(1.84±0.57,1.08±0.15)、缺氧NC组(2.10±0.35,1.02±1.14)组FOXO3a mRNA和蛋白表达均高于缺氧siFOXO3a组(0.21±0.66,0),差异有统计学意义(P<0.05)。缺氧组和缺氧NC组FOXO3a mRNA和蛋白表达均高于常氧组,差异有统计学意义(P<0.05)。4缺氧条件下沉默FOXO3a后HTR8-SVneo细胞侵袭和凋亡能力的变化细胞侵袭数目:缺氧组(35.83±4.71)个、缺氧NC组(38.33±4.55)个和缺氧siFOXO3a组(58.33±6.28)个细胞侵袭数目均低于常氧组(72.83±9.87)个,差异有统计学意义(P<0.05);但缺氧siFOXO3a组细胞侵袭数目高于缺氧组和缺氧NC组,差异有统计学意义(P<0.05)。细胞凋亡率:缺氧组(27.20±1.43)%、缺氧NC组(28.29±1.33)%和缺氧siFOXO3a组(12.17±1.40)%细胞凋亡率均高于常氧组(8.06±1.21)%,差异有统计学意义(P<0.05);但是缺氧siFOXO3a组细胞凋亡率低于缺氧组和缺氧NC组,差异有统计学意义(P<0.05)。5缺氧条件下沉默HIF-1α后HTR8-SVneo细胞中HIF-1α、FOXO3amRNA和蛋白的表达5.1缺氧条件下沉默HIF-1α后HTR8-SVneo细胞HIF-1α mRNA及其蛋白的表达常氧组(1.04±0.08,0.40±0.05)、缺氧组(1.10±0.17,1.09±0.14)和缺氧 NC 组(1.18±0.16,1.04±0.15)HIF-1αmRNA 和蛋白表达均高于缺氧 siHIF-1α组(0.29±0.06,0.12±0.06),差异有统计学意义(P<0.05)。缺氧组和缺氧NC组HIF-1α蛋白表达高于常氧组,差异有统计学意义(P<0.05)。5.2缺氧条件下沉默HIF-1α后HTR8-SVneo细胞FOXO3a蛋白表达常氧组(0.27±0.05)、缺氧组(1.02±0.07)和缺氧NC 组(1.07±1.11)FOXO3a蛋白表达均高于缺氧siHIF-1α组(0.13±0.03),差异有统计学意义(P<0.05);缺氧组和缺氧NC组FOXO3a蛋白表达高于常氧组,差异有统计学意义(P<0.05)。6缺氧条件下沉默HIF-1α后HTR8-SVneo细胞侵袭和凋亡能力的变化细胞侵袭数目:缺氧组(32.33±4.50)个、缺氧NC组(36.17±5.31)个和缺氧siHIF-1α组(51.50±6.78)个细胞侵袭数目低于常氧组(68.17±10.09)个,差异有统计学意义(P<0.05);但是缺氧siHIF-1α组细胞侵袭数目高于缺氧组和缺氧NC组,差异有统计学意义(P<0.05)。细胞凋亡率:缺氧组(27.20±1.43)%、缺氧NC组(27.88± 1.22)%和缺氧siHIF-1α组(14.36±1.07)%细胞凋亡率均高于常氧组(8.06±1.21)%,差异有统计学意义(P<0.05);但是缺氧siHIF-1α组细胞凋亡率低于缺氧组和缺氧NC组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论缺氧条件下HIF-1α可通过增加FOXO3a表达,减弱滋养细胞的侵袭能力并且增加滋养细胞的凋亡能力,进而可能参与子痫前期的发生发展。