B7-H6是新发现的自然杀伤细胞（natural killer cells，NK）活化性受体NKp30的配体，也是目前NKp30识别的唯一的位于肿瘤细胞表面的配体，B7-H6通过绑定受体NKp30介导NKp30依赖的NK细胞毒性和细胞因子分泌。人B7-H6基因全长1365bp，位于染色体11p15.1，编码454个氨基酸。B7-H6属于压力诱导的自身分子，它选择性地表达在一些肿瘤细胞以及恶性血液病患者的血和骨髓单个核细胞表面，促炎细胞因子刺激以及放疗、化疗、热疗、细胞因子等抗肿瘤治疗可以诱导正常外周血单个核细胞表达B7-H6。血清可溶性B7-H6的表达水平与肿瘤的转移以及化疗后肿瘤进展呈正相关，测定血清中的B7-H6浓度可成为评估肿瘤进展及预后的新的临床指标。　　本文通过对慢性粒细胞性白血病（简称慢粒）慢性期患者和健康对照组外周血和骨髓标本中B7-H6基因表达量的检测发现，慢粒患者B7-H6基因表达量显著低于健康对照组，提示慢粒患者与健康对照组的B7-H6基因表达水平存在差异，这为慢粒患者的临床诊疗提供了新依据。为进一步探讨慢粒患者B7-H6的蛋白表达水平的变化，探究可溶性B7-H6与慢粒进展的相互关系，为临床建立新的检测方法，我们通过扩增B7-H6全长基因，获得了稳定转染B7-H6的细胞株，以此为免疫原运用杂交瘤细胞技术制备了鼠抗人B7-H6单克隆抗体并对其进行了初步的研究，为进一步建立特异性的体外检测试剂盒提供条件。　　第一部分 B7-H6在慢性粒细胞性白血病中的表达　　目的：检测慢性粒细胞性白血病患者外周血和骨髓单个核细胞B7-H6的基因表达水平，探究B7-H6在慢性粒细胞性白血病患者外周血和骨髓单个核细胞的变化。　　方法：应用实时荧光定量PCR技术检测慢粒外周血和骨髓单个核细胞以及慢粒细胞株Meg-01和K562细胞基因表达并与健康对照组进行比较。　　结果：与健康对照组相比（1.051±0.337），慢粒患者外周血B7-H6 mRNA表达显著减少（0.014±0.008，p<0.001），同时检测慢粒细胞株Meg-01和K562细胞B7-H6转录本含量也显著低于健康对照组。慢性粒细胞性白血病患者骨髓细胞B7-H6 mRNA表达与对照组无显著差异（P=0.292）。　　结论：慢粒患者与健康对照组的B7-H6基因表达水平存在差异，为慢粒患者的临床诊疗提供了新依据。此外，B7-H6基因与蛋白表达呈负相关，提示转录后调控可能参与了慢性粒细胞性白血病的病程进展。　　第二部分人B7-H6基因稳转细胞株的建立　　目的：构建重组真核表达载体pCMV3-B7-H6和pMH3-B7-H6及其稳转细胞株NIH/3T3/B7-H6和CHO/B7-H6，表达非分泌型B7-H6抗原和分泌型B7-H6抗原，为制备鼠抗人B7-H6单克隆抗体提供抗原。　　方法：运用聚合酶链式反应技术（polymerase chain reaction, PCR）从人肺腺癌细胞株A549中扩增出人B7-H6的全长基因，双酶切后重组入真核表达载体pCMV3和pMH3。通过电转染技术将测序正确的重组表达载体分别转染小鼠成纤维细胞株NIH/3T3和仓鼠卵巢细胞株CHO；前者潮霉素筛选，后者G418筛选后单克隆获得稳转细胞株2H8（NIH/3T3-B7-H6）和CHO-B7-H6，经PCR，流式细胞术和蛋白免疫印迹（western blot, WB）检测B7-H6的基因和蛋白表达。　　结果：成功构建重组真核表达载体pCMV3-B7-H6和pMH3-B7-H6。稳转细胞株2H8和CHO-B7-H6均能检测到B7-H6的基因和蛋白表达。　　结论：成功构建非分泌型B7-H6稳转细胞株2H8和分泌型B7-H6稳转细胞株CHO/B7-H6，为制备鼠抗人B7-H6单克隆抗体提供了抗原。　　第三部分鼠抗人B7-H6单克隆抗体的制备　　目的：制备鼠抗人B7-H6单克隆抗体，筛选识别不同抗原表位的单克隆抗体，对其生物学特性进行鉴定并对其功能进行初步研究。　　方法：稳转细胞株2H8免疫Balb/c小鼠，运用杂交瘤细胞技术制备单克隆抗体。运用蛋白免疫印迹，细胞免疫荧光及流式细胞术等对单克隆抗体的生物学特性进行鉴定。采用体内诱生法大量制备单克隆抗体，根据表型鉴定结果选择合适的纯化方法。采用流式细胞术检测单抗对不同肿瘤细胞株表面B7-H6分子的识别，采用免疫组织化学技术检测单抗对不同肿瘤组织表面B7-H6分子的识别。　　结果：获得1株持续稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为1D9。杂交瘤细胞株经液氮冻存后复苏，细胞生长状态良好并仍可保持稳定分泌抗体的特性。经快速商品化鼠抗体亚型鉴定试纸条鉴定，重链为IgM,轻链为κ链。单抗能够特异性识别稳转细胞株的蛋白条带，经流式细胞分析能够检测到强而特异的荧光；细胞免疫荧光能够特异性地检测到定位于膜上的B7-H6。单克隆抗体的抗原表位竞争实验结果显示，单抗1D9与B7-H6抗原的结合能够被商品化单抗阻断。单抗1D9能够识别人白血病细胞株（CCRF-CEM，Raji，Nalmawa，Ramos，Dami，K562，NB4，THP-1）、肝癌细胞株HepG2、肺腺癌细胞株NCI-H1975、结肠癌细胞株SW620、骨肉瘤细胞株SW1353表面的B7-H6分子。同时，单抗1D9还能够特异性识别乳腺癌组织标本中的B7-H6。此外，1D9能显著抑制SW1353细胞的迁移和增殖；对HepG2细胞的迁移有显著抑制作用，但对其增殖无影响。　　结论：成功获得1株稳定持续分泌鼠抗人B7-H6单克隆抗体的杂交瘤细胞株1D9，1D9和商品化单抗识别的抗原表位接近，该抗体可以用于免疫印迹，流式细胞术，细胞免疫荧光和细胞免疫组化的检测以及功能的初步研究，为进一步探究B7-H6在肿瘤发生发展中的作用奠定了基础。