目的:外周神经损伤是一类临床中经常遇到的创伤,损伤发生后,如果不能及时有效的进行修复,受损神经远端会发生华勒变性,导致先前其支配的效应器官慢慢的萎缩,势必会影响后续康复治疗的效果。白藜芦醇为二苯乙烯类化合物,是中药材虎杖中的主要活性成分之一,同时虎杖也是自然界中白藜芦醇的主要来源。白藜芦醇具有多种药理活性,近年研究发现其对外周神经损伤也具有一定药理活性,如可增加视神经切断后神经节细胞的存活率。但这些研究中均使用白藜芦醇溶液给药,并无制剂的应用,由于白藜芦醇水溶性差,溶液给药存在生物利用度低的问题,因有必要借助现代药剂学理论和新技术来解决上述问题。本课题将脂质体剂与温敏凝胶剂相结合,构建了一种复合释药体系,用来包载白藜芦醇,即可解决其溶解度问题又可达到定位释放的目的。当此制剂被注射在神经受损部位,会在注射部位形成原位凝胶,起到类似药物储库缓慢释放药物目的,从而提高对受损神经修复的效果。并且通过药剂、药理和药动三方面对所构建的白藜芦醇脂质体温敏凝胶剂进行系统的评价。方法:实验一、处方前研究1、建立白藜芦醇体外HPLC分析方法。2、建立白藜芦醇脂质体包封率测定方法。3、采用摇瓶法测定白藜芦醇的平衡溶解度和油/水分配系数。4、合成并表征温敏凝胶剂所用三嵌段聚合物材料。实验二、白藜芦醇脂质体温敏凝胶剂的制备及表征1、以包封率和载药量为衡量指标,通过单因素实验与响应面法Box-Behnken设计相结合来筛选和优化白藜芦醇脂质体的处方工艺,以相变温度和胶凝时间为衡量指标,通过单因素实验与正交实验设计相结合来确定最佳的脂质体温敏凝胶剂的处方工艺。2、通过理化性质考察、安全性评价和稳定性初步研究三部分对制备的脂质体温敏凝胶剂进行表征。理化性质考察包括测定制剂含量、包封率、粒径和Zeta电位、透射电镜观察形态及脂质体温敏凝胶剂的相转变过程表征。安全性评价包括肌肉刺激性实验和溶血率检测。同时制剂进行为期28天的稳定性考察。3、白藜芦醇脂质体温敏凝胶剂体外释放行为研究,采用无膜释放模型进行溶蚀性考察,透析袋法进行释放度考察。实验三、白藜芦醇对氧化损伤的大鼠雪旺细胞修复作用的研究1、经SD乳鼠的坐骨神经组织提取分离纯化大鼠雪旺细胞。2、使用双氧水做为氧化剂来构建大鼠雪旺细胞氧化损伤模型。3、考察白藜芦醇对氧化损伤大鼠雪旺细胞修复作用的机制。实验四、白藜芦醇脂质体温敏凝胶剂对大鼠坐骨神经损伤修复作用的研究1、建立SD大鼠坐骨神经损伤动物模型。2、分别通过动物行为学、病理切片和坐骨神经组织中目的蛋白的变化来综合评估白藜芦醇脂质体温敏凝胶剂对大鼠坐骨神经损伤修复的作用。实验五、白藜芦醇脂质体温敏凝胶剂动物体内药动学研究1、建立白藜芦醇血药浓度检测方法和组织中残留药物检测方法。2、进行白藜芦醇脂质体温敏凝胶剂动物体内药动学实验,并与脂质体剂比较药动学差异。3、使用新吲哚箐绿（IR-820）为荧光探针,考察脂质体温敏凝胶剂的动物体内滞留情况。结果:实验一、处方前研究1、对所建立的白藜芦醇体外分析方法进行方法学验证,可知白藜芦醇在浓度为2.0-12.0μg/mL范围内,与峰面积呈现良好的线性关系,回归方程为Y=128715X+2552.1,R=0.9951。且加样回收率在97.2-101.8%之间,RSD值小于2%;日内精密度和日间精密度的平均RSD均小于2%,以上说明所建立的方法可以满足分析要求。2、建立了切实可行且操作简便的微型柱离心法对白藜芦醇脂质体进行包封率检测,在1000 g离心力下离心5 min,经过3次循环可以有效的分离包封的白藜芦醇,回收率达到95%以上。3、考察了白藜芦醇的平衡溶解度,实验结果显示白藜芦醇在pH6.8的磷酸盐缓冲液中取得了最大溶解度,在水中的溶解度较小,属于微溶范围。实验计算得到的白藜芦醇的logP值在2-3之间,属于具有中等强度的亲脂性的物质。4、对开环聚合法合成的PLGA-PEG-PLGA三嵌段聚合物通过¹H-NMR、红外光谱和GPC进行了表征,所合成的聚合物分子量在4600-6400 Da之间,聚合物单体中乙交酯和丙交酯的摩尔比为1:2。实验二、白藜芦醇脂质体温敏凝胶剂的制备及表征1、通过单因素实验并结合响应面Box-Behnken设计优化实验,确定了白藜芦醇脂质体的最优处方为磷胆比:为5:1、药脂比:为1:21,水合温度40℃超声功率160 att,超声时间15 min。随后经过单因素实验和正交实验确定了白藜芦醇脂质体温敏凝胶剂的最佳处方为脂质体浓度50%,聚合物浓度20%,甘露醇浓度1%,氯化钠浓度0.9%。2、对制备的白藜芦醇脂质体温敏凝胶剂进行了理化性质的表征,粒径范围为210.5±4.7 nm,Zeta电位为-4.73±0.16 mv,透射电镜观察到近似球形的外观,流变学检测相变温度为33.2℃。通过病理切片观察注射部位的肌肉并无毒性反应,且溶血率在5%以内符合《中国药典》2015版里关于注射用药的规定。制剂可在4℃稳定存放28天,主要理化指标并未发生显著变化。3、通过溶蚀性考察发现脂质体温敏凝胶在24 h内的累计溶蚀量达到59.1%,而后续时间检测点的溶蚀速率有降低的趋势,在实验结束后累积溶蚀量超过了90%以上。通过释放度考察可知脂质体温敏凝胶剂与其它剂型相比显著的延长了药物释放时间,且释放行为符合Ritger-peppas模型。实验三、白藜芦醇对大鼠雪旺细胞氧化损伤修复作用的研究1、利用差速贴壁法成功培养和纯化了大鼠雪旺细胞,细胞培养48 h后呈现出由不规则的梭形突触相互交织形成的网状,经免疫荧光染色鉴定可知所提取的细胞表达S-100蛋白,此蛋白为大鼠雪旺细胞特异性蛋白。2、通过CCK8试剂来筛选大鼠雪旺细胞氧化损伤模型所用双氧水和白藜芦醇的浓度,最终选择400μM的双氧水作为氧化剂浓度,40μM的白藜芦醇作为给药浓度。3、通过白藜芦醇前处理双氧水氧化损伤的大鼠雪旺细胞,发现白藜芦醇可以升高受损细胞的p-Akt/Akt和Bcl-2/Bax蛋白表达,降低MDA的含量和提高SOD的活性,抑制受损细胞的凋亡。实验四、白藜芦醇脂质体温敏凝胶剂对大鼠坐骨神经损伤修复作用的研究1、采用挤压伤法制备了SD大鼠坐骨神经损伤动物模型。2、将制备的温敏凝胶剂应用于大鼠坐骨神经损伤模型,发现脂质体温敏凝胶剂高剂量组相对于低剂量组和白藜芦醇游离药物组可以显著的减小坐骨神经损伤指数,降低热缩足时间和机械性痛阈值,增加神经元髓鞘厚度,腓肠肌纤维面积。且相对于模型组坐骨神经组织中的Bax蛋白表达值显著降低而Bcl-2蛋白表达值显著升高,神经营养因子的含量显著性增高,从而促进受损的坐骨神经的再生。实验五、白藜芦醇脂质体温敏凝胶剂动物体内药动学研究1、建立了白藜芦醇动物体内血药浓度和组织中残留药物的测定方法,并进行了完整的方法学验证。结果表明白藜芦醇在全血中的加样回收率在88.5-91.6%之间,在0.03-1.20μg/mL范围内,含量与峰面积呈现良好的线性范围,回归系数为0.9942,精密度RSD值在2%以内。残留药物方法学验证表明,组织匀浆液加样回收率在90.1-96.9%之间,线性范围为0.10-10.0μg/mL,回归系数为0.9901,精密度实验RSD值也在2%以内。证明所建立的方法可以用来进行实际样品的测定。2、进行了白藜芦醇脂质体温敏凝胶剂动物体内药动学的研究,表明脂质体温敏凝胶剂体内的消除半衰期t_1/2和MRT为脂质体剂型的4.2倍和4.0倍,AUC面积也要远大于脂质体剂,可持续释放药物达168h。脂质体温敏凝胶剂组在实验设计的取样时间内,组织中均可检测到残留的药物,从侧面也证实了温敏凝胶剂可在体内形成类似的药物储库达到缓慢释放的目的。3、以新吲哚箐绿（IR-820）为荧光探针采用小动物活体成像的方法对脂质体温敏凝胶剂体内滞留情况进行了考察,结果显示相对于脂质体剂,脂质体温敏凝胶剂可以显著的增加药物在体内的滞留性。结论:白藜芦醇脂质体温敏凝胶剂制备工艺可行,无生物毒性,所制备的样品在4℃可稳定存放28天。所采用的温敏凝胶聚合物基质并不影响脂质体的包封率和形态。体外释放度实验显示由于凝胶具有温敏性质可使白藜芦醇达到长效释放,体外释药曲线符合Ritger-peppas方程。并将制备的脂质体温敏凝胶剂应用于大鼠坐骨神经损伤模型,发现具有一定的促进受损神经再生的功效,其可能的原因是通过促进坐骨神经中雪旺细胞的增殖来实现的。在动物体内进行的药动学研究也进一步证实了白藜芦醇制备成脂质体温敏凝胶剂后可以显著的延长其释放时间。本实验可为研究开发中药材活性单体注射缓控释剂型提供一定参考和依据。