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[目的]体外提取培养人类外周血CD4+CD25+调节性T细胞(regulatory T cell, Treg),并验证其免疫抑制功能；分别观察雷帕霉素及环孢素对CD4+CD25+Treg细胞体外增殖的影响,初步探讨其可能机制。[方法]本实验分为两部分：第一部分,人类外周血CD4+CD25+Treg细胞的体外提取培养及功能验证：取新鲜健康成人外周血50-100mL,利用密度梯度离心法得到外周血单核细胞,然后使用人类CD4+CD25+CD127dim/-T细胞分离试剂盒Ⅱ,通过免疫磁珠法进一步提取得到CD4+CD25+Treg细胞,利用流式细胞仪检测CD4、CD25双阳性细胞纯度,然后取一部分细胞进行羧基荧光素乙酰乙酸染色,连同未经染色细胞分别转移至96孔板内进行培养,添加含CD3/CD28单克隆抗体所包被的磁珠及高浓度重组人IL-2等的RPMI-1640完全培养基,于37.5℃、饱和湿度、5%C02浓度条件下进行培养,7天后将染色细胞进行流式细胞仪检测明确其增殖情况,其余未染色CD4+CD25+Treg细胞继续培养7天,定期更换培养基,进行细胞计数及细胞传代；将免疫磁珠法阳性选择中所保留的CD4+CD25-T细胞(效应性T细胞)用羧基荧光素乙酰乙酸标记后与同种同体CD4+CD25+Treg细胞1：1混合培养7天,然后经流式细胞仪检测观察分析CD4+CD25-T细胞的受抑制情况；第二部分,雷帕霉素及环孢素对人体外周血CD4+CD25+Treg细胞体外增殖的影响：将提取所得CD4+CD25+Treg细胞全部进行羧基荧光素乙酰乙酸标记,然后将细胞分成三组,每组至少设置3个复孔进行培养,在加入上述培养基的基础上,第一组添加浓度为100nmol/L的雷帕霉素试剂,第二组添加浓度为410nmol/L的环孢素试剂,第三组为空白对照组,不添加任何其他试剂。三组细胞于相同环境下培养,定期更换培养基并添加相应试剂,7天后进行流式细胞仪检测,分析两种药物对CD4+CD25+Treg细胞体外增殖的影响。数据运用SPSS13.0软件进行统计学处理,结果以均数±标准差表示,采用配对样本t检验,检验水准α=0.05。[结果]第一部分：通过密度梯度离心法结合免疫磁珠法共提取CD4+CD25+Treg细胞15例,其中1例出现细胞污染,6例双阳性率低于80%,予以丢弃,其余8例CD4+CD25+Treg细胞纯度达到(97±0.8)%,且细胞内Foxp3表达率达(99±0.5)%。CD4+CD25+Treg细胞体外正常分化增殖,适宜条件下培养7天后流式细胞仪检测原代细胞比例占(37.0±3.5)%,14天后光学显微镜下计数细胞数量可扩增至150倍左右；体外CD4+CD25+Treg细胞与CD4+CD25-T淋巴细胞1：1混合培养7天后,流式细胞仪检测CD4+CD25-T淋巴细胞原代细胞比例占(79.4±6.9)%,经统计学分析CD4+CD25+Treg细胞可明显抑制CD4+CD25T淋巴细胞的增殖(P<0.05)。第二部分：雷帕霉素组中CD4+CD25+Treg细胞培养7天后经流式细胞仪检测原代细胞所占比例为(8.8±3.2)%,空白对照组中原代细胞所占比例为(33.2±4.3)%,通过统计学分析可知雷帕霉素明显促进了CD4+CD25+Treg细胞的体外增殖(P<0.05)；相反的,经检测环孢素组中,CD4+CD25+Treg细胞培养7天后原代细胞所占比例为(48.9±7.0)%,与空白对照组相比,环孢素明显抑制CD4+CD25+Treg细胞的体外增殖(P<0.05)。[结论]①免疫磁珠法提取得到的CD4+CD25+Treg细胞纯度可达到95%以上,Foxp3表达率达99%以上,且具有省时高效、便于操作等众多优点,是进行CD4+CD25+Treg细胞相关研究的理想提取方式;②雷帕霉素对CD4+CD25+Treg细胞的体外增殖起着明显促进作用,而环孢素则抑制CD4+CD25+Treg细胞的增殖分化,可见从CD4+CD25+Treg细胞的角度分析,雷帕霉素一定程度上有利于移植后患者免疫耐受的形成,而环孢素则不利于其形成。