枇杷(Eriobotrya japonica(Thunb.)Lindl.系蔷薇科枇杷属,因其果子形似琵琶而得名,是我国南方重要经济树种和名贵特色果树之一。枇杷果实色泽美观,果肉柔软多汁,鲜美可口,营养丰富,同时具有化痰、止咳、生津润肺、促进食欲和帮助消化等保健功效,深受消费者喜爱。随着产业发展和市场需求的改变,生产中枇杷品种问题日益突出,红肉型枇杷虽然果大,但风味淡,口感差;白肉型枇杷肉质细腻、口感极佳,但果实较小,耐贮性差等品种问题已不能满足枇杷产业特色资源的需要。因此加速培育高品质枇杷新品种是我国枇杷产业可持续发展的重要保障和有效措施。枇杷果实品质是决定枇杷商品性的最重要因素,其形成机理十分复杂,利用分子标记挖掘枇杷果实品质形成关键基因,可获得果实品质重要性状基因的紧密连锁标记,将其用于枇杷分子标记辅助育种,能大大缩短枇杷新品种的选育时间。本研究以项目组在四川省阿坝州茂县发现的变异植株(普通红肉型枇杷树干中部发现一芽变枝,该枝结出的果实为白肉变异类型)为材料,采用田间表型、室内生理生化、分子标记鉴定及克隆测序等手段,明确了变异植株的野生型(TBY)和突变型(TBW)的生物学特性及果实品质差异,获得了 TBY和TBW之间2条多态性特异片段,克隆分析了NAD+-SD 基因在TBY和TBW及9个对照枇杷材料中CDS序列,主要研究结果如下:1、通过田间调查及生理生化测试分析,明确了 TBY与TBW物候期、叶及果实品质差异。TBY和TBW的枝梢抽生时期、植株的始花期、盛花期以及终花期都十分相近,但TBW果实的开始成熟期比TBY果实的开始成熟期晚7d左右;TBY与TBW叶片的叶齿密度、叶齿深度、叶尖形状、叶横切面形状、叶上表面绿色程度等形态指标基本相似,TBW叶片长度、叶柄长度明显长于TBY,叶片厚度却薄于TBY;TBY和TBW果实果形、果皮和果肉颜色等外观品质存在较大差异,TBY果实的果形为椭圆形,果皮橙黄色,果肉橙红色,TBW果实的果形为近圆形,果皮黄色,果肉黄白色;TBY与TBW果实的果肉质地存在一定差异,TBY果实的果肉质地疏松,TBW果实的果肉质地细嫩,TBW果肉粗纤维含量比TBY果肉粗纤维含量低12.5%,TBW果实的可食率比TBY低5%;TBY和TBW成熟果实可溶性糖的主要成分为果糖、葡萄糖和蔗糖,TBW果实的果糖、蔗糖含量分别高出TBY果实的果糖含量14.9%、蔗糖含量90.9%,TBW果实相对甜度高出TBY24.5%;TBY和TBW果实的维生素C含量相同,均为4.53mg/100g,TBY果肉β-胡萝卜素含量大大高于TBW,TBW仅为TBY果肉β-胡萝卜素含量的7.55%;通过TBY、TBW嫁接植株的果实品质分析,进一步证明TBW白肉变异性状是稳定的。2、利用SSR、ISSR和SRAP 3种分子标记对TBY和TBW基因组模板检测,发现116对SSR标记和9x11 SRAP引物对组合所扩增条带在TBY和TBW样本中均未检测到多态性;95条ISSR引物检测表明,其中40条引物扩增较好,每条引物可以扩增出5～12条DNA片段,平均每条引物可扩增出8.2条DNA片段;7 条 ISSR 引物 UBC807、UBC813、UBC834、UBC842、UBC854、UBC880 和UBC881在TBY和TBW材料间存在不显著的多态性,这些条带扩增较弱并且不稳定,其它ISSR引物扩增条带在TBY和TBW材料间不存在差异;SSR、ISSR、SRAP标记结果表明,TBY和TBW的DNA基因组背景几乎一致,二者之间多态性片段极少,从分子水平证实TBW为TBY植株的芽变枝。3、通过对7条具有多态性的ISSR引物以及前人的OPH-01/1800bp标记多次重复扩增,获得 UBC854(TB1)、UBC813(TB2)、OPH-01/1800bp(TB3)3 条多态性条带,大小分别为1369 bp、535 bp、1719 bp,这3条差异片段均在TBY出现,在TBW缺失。通过NCBI数据库tblastx比对,TB1为非特异扩增片段,TB2碱基序列与枇杷果实发育中编码依赖NAD的山梨醇脱氢酶蛋白基因、苹果或梨属编码1-氨基环丙烷-1羧酸(ACC)合成酶蛋白基因等有较高同源关系;TB3与编码梨F-box蛋白、S-核酸酶和S核糖核酸酶及苹果MdSFBB9S9-α、S9核糖核酸酶和MdSFBB9S9-β等基因同源性较高。4、克隆TBY、TBW、大五星、黄丰、茂木、大白梨、白沙、贵妃、香钟11、晚钟518和新白8号果肉的NAD+-SDH基因CDS序列,发现相对于TBY和其它9个对照枇杷品种,TBW果肉的NAD+-SDH基因CDS序列存在3个SNP变异位点,其变异位点编码的氨基酸均发生了相应的变化。3个SNP相应氨基酸的变异对NAD+-SDH基因功能的影响有待深入研究。5、对NAD-SDH酶活性、山梨醇及果糖含量测试表明,相对于TBY,从果实转色到成熟TBW的NAD-SDH酶活性呈现低高低的趋势,山梨醇含量呈现高高低的变化,果糖含量突变型则一直高于TBY;实时荧光定量PCR分析表明,TBW成熟果肉NAD+-SDH基因的表达量比TBY低5倍左右;NAD-SDH酶促进枇杷果实的山梨醇转化生成果糖,分析推测,3个SNP位点变异可能导致成熟期TBW枇杷NAD-SDH酶过多地促进山梨醇转化合成果糖,从而使果糖含量增高,转录后mRNA表达丰度相对降低,NAD+-SDH基因可能是导致TBW枇杷果肉颜色和糖分变异的关键基因。