研究背景和目的：中医“脾主运化”、脾为“后天之本,气血生化之源”之说,揭示脾对于饮食物具有消化吸收和输转的功能,同时脾通过营养物质在体内的代谢,为人体出生以后生长发育及生命活动提供能量和物质基础。物质能量代谢是生命活动的物质基础,它包括消化吸收、中间代谢和排泄三个阶段,中间代谢是机体内代谢的主体,包括糖、脂、蛋白质、核酸、微量元素和能量代谢等(本论文物质代谢特指糖、脂、蛋白质、核酸和微量元素代谢)。目前已有大量的研究证实脾虚动物存在消化吸收和营养代谢障碍,在中间代谢方面表现为糖原含量降低；血脂含量和生物膜结构异常；氨基酸和蛋白含量降低；组织DNA和RNA含量降低；线粒体结构异常,ATP含量降低；微量元素含量异常等,可见,脾与物质能量代谢在病理上也表现出高度的一致。目前脾虚证与物质能量代谢相关性研究主要以对某一代谢相关生化指标的测定为主,缺乏对脾虚证机体整个物质能量代谢的同步研究。基因芯片技术作为一个“组学”研究方法,与中医的“整体观”有很多相似之处,它可以反映机体某一状态所有基因的表达情况。因此,在本世纪初,基因芯片技术就已经广泛用于脾虚证动物模型的研究,但是由于我国利用基因芯片技术研究脾虚证的起步相对较晚,基因芯片数据的分析存在一些明显不足,如对芯片数据的预处理不够,对差异表达基因缺乏统计学检验,并且对于差异表达基因的功能注释也过于单一,最终导致对芯片数据的解读浮于表面,未能达到预期目的。随着分子生物学和生物信息学的发展,一些专业的生物信息学软件已经广泛用于基因芯片数据的分析,这大大提高了基因芯片数据的解读能力,并且随着大量基因芯片数据的积累,使得广泛利用现有基因芯片数据来解读脾虚证的发病机制比少量基因芯片实验本身更为重要。对此,在课题组应用基因芯片研究慢性浅表性胃炎脾气虚证(下称脾虚证)基因表达谱的工作基础上,本文利用BRB ArrayTools和IPA软件对慢性浅表性胃炎(下称慢性胃炎)脾虚证患者(分别以健康志愿者和脾胃湿热证患者作为对照)和非幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, Hp)感染脾虚证患者(与Hp感染脾胃湿热证患者相比)基因芯片数据进行深入挖掘,通过对前者物质能量代谢相关差异表达基因分析,探讨脾虚证与物质能量代谢的相关性,从机体整个物质能量代谢水平认识脾的生理功能和脾虚证的发病机制；通过对后者差异表达基因分析,探讨Hp的致病机制,同时认识“慢性胃炎脾胃湿热证患者Hp感染率明显比脾虚证患者高”这一临床现象的遗传背景,为中医分型和Hp相关疾病的治疗提供理论依据。此外,论文还汇总了近10年气虚证或体质人和脾虚大鼠模型差异表达基因,通过对脾虚证患者、气虚证或体质人和脾虚大鼠模型物质能量代谢相关差异表达基因的相似性比较,探讨脾虚证基因表达谱的特征,并筛选出脾虚证特征性代谢基因和代谢途径,从基因组学的角度为中医脾基础理论的现代科学诠释和脾虚证临床辨证分型提供参考,并为脾虚证的病理生理研究提供线索。材料与方法：一、材料(一)基因芯片数据来源慢性胃炎脾虚证患者与健康志愿者比较和脾虚证患者与脾胃湿热证患者比较的基因芯片原始数据,以及慢性胃炎非Hp感染脾虚证患者与Hp感染脾胃湿热证患者比较的基因芯片原始数据全部来自于课题组脾虚证发病机理研究的前期数据,并已有相关论文发表。包括肺气虚证、气阴两虚证、气虚体质在内的气虚证或体质人差异表达基因全部来源于公开发表的学术论文和学位论文。包括不同建模方法和组织来源的脾虚大鼠模型差异表达基因全部来源于公开发表的学术论文和学位论文。(二)用于脾虚证与脾胃湿热证比较的差异表达基因验证的荧光定量PCR实验病例来源1.诊断标准及辨证分型标准慢性胃炎西医诊断和辨证分型标准以及Hp诊断标准全部采用课题组原实验设计标准(王颖芳,广州中医药大学2006届博士学位论文),具体如下：(1)慢性胃炎诊断标准参照《中药新药临床研究指导原则》。(2)脾气虚证辨证标准主症：①舌质淡、舌体胖或有齿印,苔薄白；②胃纳减少或食欲差；③腹胀；④大便溏或腹泻。次症：①消瘦；②体倦乏力；③脉细弱。判断：a)主症①必备。b)兼具主症②、③、④之二；或兼具主症②、③、④之一,同时兼具2个以上次症,诊断可成立。(3)脾胃湿热证辨证标准主症：①舌苔黄腻；②胸闷；③胃脘痞满或胀痛；④食欲不振。次症：①口苦而黏；②口渴少饮,或喜热饮；③大便溏,或有黏液；④恶心；⑤身困乏力；⑥脉濡缓,或滑。判断：a)主症①必备。b)兼具主症②、③、④之二,或兼具主症②、③、④之一,同时兼具2个以上次症；或兼具3个以上次症,诊断可成立。(4)Hp诊断标准患者近一个月内未服用抗生素类药物。病理切片染色与快速尿素酶试验二者均为阳性即为Hp感染。两者均为阴性即为非Hp感染。2.纳入及排除标准同时符合慢性胃炎非Hp感染脾虚证或Hp感染脾胃湿热证,并同意签署由学术道德委员会批准的《知情同意书》的患者纳入。年龄在18岁以下或65岁以上,妊娠或哺乳妇女,过敏体质者,或存在消化道其它器质性病变、心、脑、肝、肾、造血系统等严重原发性疾病及精神性疾病等患者被排除。二、方法(一)脾虚证患者差异表达基因分析慢性胃炎脾虚证患者与健康志愿者比较和脾虚证患者与脾胃湿热证患者比较的基因芯片原始数据,以及慢性胃炎非Hp感染脾虚证患者与Hp感染脾胃湿热证患者比较的基因芯片原始数据,采用下述方法进行分析处理：1.基因芯片数据的预处理和数据筛选对Cy5和Cy3信号值进行均一化处理,消除两标记体系间的系统误差。参与均一化处理的有效基因点的条件：(1)该基因点的Cy3和Cy5信号值都大于200,或者其中之一大于800；(2)该基因点的Cy5信号值/Cy3信号值的比值在0.1-10之间。均一化系数计算方法：计算每个有效基因点Cy5信号值/Cy3信号值的比值,求出其相应的自然对数值r=ln(Cy5/Cy3),算出全部有效基因点r值的平均值R,那么实验的均一化系数就等于R的倒数即(1/R)。将所有基因点的Cy3信号值乘上均一化系数,得出调整后的Cy3*,即Cy3*=Cy3×(1/R),并将所有小于200的Cy3*值以200取代,所有小于200的Cy5信号值用200替代。将Cy5和Cy3*信号值输入芯片分析软件BRBArrayTools4.1.0Beta2进行数据筛选,包括对数转换、中位值标准化和基因筛选。其中某个基因被保留用于后续分析的基因筛选条件是：该基因的Cy5/Cy3*比值必须有超过20%的样本大于1.5,且不能有超过50%的数据缺失。对筛选后的数据进行功能注释和进一步分析。2.GO和KEGG基因集分析对筛选后的芯片数据进行GO和KEGG基因集分析。基因芯片分析时,将健康志愿者或脾胃湿热证患者作为对照组,将脾虚证患者作为实验组。Hp分析时,将非Hp感染脾虚证患者作为对照组,Hp感染脾胃湿热证患者作为实验组。采用配对t检验的方法,显著性检验方法为LS/KS排列检验和Efron-Tibshirani’s基因集分析最大均值检验(GSA maxmean test), P<0.005。3.芯片间分类对比分析(1)差异表达基因筛选对筛选后的数据进行芯片间的分类对比分析。基因芯片分析时,实验组和对照组设置同上。采用配对t检验的统计方法,将同时满足P<0.05或p<0.01或p<0.001和表达倍数>2的基因设定为差异表达基因。对表达倍数<1的基因数据进行负倒数转换,因此倍数为正的基因是实验组上调基因,负值表示实验组下调基因,分别标记为“↑”和“↓”。(2)差异表达基因生物信息分析将差异表达基因ID和表达倍数导入IPA8.6在线软件对差异表达基因进行注释、相互作用网络等生物学功能分析。对于脾虚证分别与健康志愿者和脾胃湿热证患者比较的差异表达基因根据BRB Array Tools软件的GO功能分析中的生物学过程和KEGG通路以及IPA在线软件的生物学功能分类和基因的生物学注释四方面信息综合确定物质能量代谢相关基因,分析脾虚证与物质能量代谢的相关性；对于非Hp感染脾虚证差异表达基因,通过差异表达基因功能注释和相互作用网络分析,探讨Hp的致病机制,为中医分型和Hp相关疾病的治疗提供理论依据。(3)基于差异表达基因的聚类分析利用BRB Array Tools软件的聚类功能,选择基因中心化、一减相关系数和平均连接簇设置,以选定的差异表达基因作为分析对象(Hp分析时选定所有差异表达基因,其他两组芯片分析选定物质能量代谢相关差异表达基因),对样本和基因进行层级聚类分析。(二)脾虚证患者、气虚证或体质人和脾虚大鼠模型物质能量代谢相关差异表达基因相似性比较1.脾虚证患者两组芯片的物质能量代谢基因之间相似性比较对脾虚证患者与健康志愿者比较的物质能量代谢相关差异表达基因和脾虚证与脾胃湿热证患者比较的物质能量代谢相关差异表达基因进行相似性比较,分析脾虚证患者差异表达基因的特征,并筛选出脾虚证患者特征性的基因和代谢途径,进一步探讨脾虚证与物质能量代谢的关系。2.脾虚证患者物质能量代谢基因和气虚证或体质人物质能量代谢基因相似性比较检索并汇总文献报道的气虚证或体质人差异表达基因,按照上述物质能量代谢相关基因的界定方法,筛选出物质能量代谢相关差异表达基因,并与脾虚证患者物质能量代谢差异表达基因进行比较,探讨脾虚证患者和气虚证或体质人在物质能量代谢基因差异表达上的异同,从而确定物质能量代谢异常是脾虚证患者特有的病理现象还是气虚证所共有的病理机制。3.脾虚证患者物质能量代谢基因和脾虚大鼠模型物质能量代谢基因相似性比较检索并汇总文献报道的脾虚大鼠模型差异表达基因,按照上述方法2,进行分析,探讨脾虚证特有的代谢基因和途径。(三)脾虚证与脾胃湿热证比较的差异表达基因荧光定量PCR验证1.胃黏膜组织的采集在广东省中医院收集慢性胃炎非Hp感染脾虚证和Hp感染脾胃湿热证患者各4例,胃镜下钳取胃窦黏膜活检组织200mg左右,液氮保存备用。2.荧光定量PCR实验论文对慢性胃炎非Hp感染脾虚证与Hp感染脾胃湿热证比较的差异表达基因HLA-DRB1、SCGN、COX7B和SULT1A4四个基因进行定量PCR验证。实验采用SYBR Green I的方法,利用primer express2.0软件设计引物,并按照相关试剂盒说明书提取总RNA、进行荧光定量RT-PCR反应,采用ΔΔCt的方法计算实验组与对照组之间的相对含量。结果：一、脾虚证患者差异表达基因(一)脾虚证与健康志愿者比较的物质能量代谢相关差异表达基因(1)GO分析获得287个有显著性意义的基因集,其中细胞成分49个、分子功能60个,生物学过程178个。KEGG分析获得11个有显著性意义的代谢通路。GO生物学过程和KEGG通路显示,脾虚证患者在涉及脂、蛋白质、核酸和糖代谢的相关基因表达异常。(2)分类对比分析获得15个物质能量代谢相关差异表达基因,占总差异表达基因的75%(15/20),其中下调基因14个,酶基因或有酶活性的基因11个(73%),它们参与机体脂、蛋白质、核酸和糖代谢过程。与脂类代谢相关的基因有ACAA2↓和CYP20A1↓,表现为脂肪酸分解和胆固醇转化降低；与蛋白质代谢相关的基因有RPS28↓、B3GNT1↓、GCNT1↓、PPP1R3C↓、UBXN1↓、UBE2D2↓、ASL↓、 ASS1↓和PCYOX1L↓、ALDH9A1↓,表现为蛋白质合成和糖基化和磷酸化修饰降低,蛋白质泛素化降解异常,参与尿素循环、自主神经等生物学过程的氨基酸代谢降低；与核酸代谢相关的基因有RMI1↓、SMARCD3↓和PARP1↑,表现为DNA复制和转录降低,DNA损伤修复增加；与糖类代谢相关的基因有B3GNT1↓、GCNT1↓和PPP1R3C↓,表现为聚糖和糖原合成降低。(3)基于物质能量代谢基因差异表达的样本聚类分析显示脾虚证患者与健康志愿者不能分开。(二)脾虚证与脾胃湿热证比较的物质能量代谢相关差异表达基因(1)GO分析获得373个有显著性意义的基因集,其中细胞成分58个、分子功能59个,生物学过程256个。这些生物学过程包括脂、蛋白质、核酸、糖代谢、微量元素和能量代谢等。KEGG分析获得2个有显著性意义的代谢通路,即核糖体和核黄素代谢。(2)分类对比分析获得56个物质能量代谢相关差异表达基因,占总差异表达基因的71%(56/79),其中下调基因45个、酶或具有酶活性的基因30个、转运蛋白基因5个,它们参与机体脂、蛋白质、核酸、糖、微量元素和能量代谢过程。与脂代谢相关的基因有ACADVL↓、LRP11↑、SULT1A4↓、CRLS1↑、GPCPD1↓、PIGL↓、 B3GNT1↓、ST8SIA4↓和FUT9↑,表现为脂肪酸p氧化降低、胆固醇摄取增加和代谢转化降低、磷脂和糖脂代谢异常；与蛋白质代谢相关的基因有ASRGL1↓、AARSD1↓、 EBNA1BP2↓、PUM2↑、MRPL52↓、C120RF65↓、PSMB8↓、PSME2↓、UBA7↓、RNF11↑、 FBX044↓、ZFYVE26↓、CHMP2A↓、SSR4↓、SNX4↑、RAB3B↓、RABL2A↓、GOLGA2↓、 KDELR1↓、PHPT1↓、ACPP↓、PTPRF↓、CRKL↓、HDAC7↓、ADPRHL2↓、B3GNT1↓、 ST8SIA4↓、DDOST↓和FUT9↑,主要表现为蛋白质的生物合成降低、蛋白质泛素化减弱、靶向输送和翻译后磷酸化和糖基化修饰降低；与核酸代谢相关的基因有TOP2A↓、 SF3A3↓、CREB3↓、CRTC2↓、NR1D2↑、MED6↓、GTF2IRD1↓、C1ORF83↓、ZNF773↓、ZMYND11↑、DFFB↓、FLJ35220↓和ADPRHL2↓,主要表现为DNA复制和转录减弱,DNA损伤修复增强；与糖代谢相关的基因有AGL↑、PTPRF↓、B3GNT1↓、FUT9↑、 ST8SIA4↓、SULT1A4↓、DDOST↓和PIGL↓,主要表现为糖原的分解增加和糖复合物的合成降低；与微量元素代谢相关的基因有COMMD1↓、FTL↓、SLC39A6↑、 CHRFAM7A↓、SCGN↑和S100A6↓,表现为铜离子和铁离子代谢下降、锌离子代谢增加、钙离子代谢异常；与能量代谢相关的基因有AK3↓和COX7B↓,表现能量代谢障碍。(3)基于物质能量代谢基因差异表达的样本聚类分析能够将脾虚证和脾胃湿热证患者分开。(三)非Hp感染脾虚证与Hp感染脾胃湿热证比较的差异表达基因(1)GO分析获得703个有显著性意义的基因集,其中细胞成分114个、分子功能114个,生物学过程475个。KEGG分析获得29个有显著性意义的代谢通路。GO生物学过程和KEGG通路分析结果一致显示,Hp感染会使宿主在涉及蛋白质代谢、信号通路、免疫炎症反应、细胞骨架等方面的基因差异表达。(2)分类对比分析获得34个有生物学功能注释的差异表达基因,它们参与蛋白质代谢、免疫和炎症反应、信号通路、基因转录、微量元素代谢等过程。(3)差异表达基因相互作用网络分析发现82%的基因被IPA软件归类到三个与基因表达、癌症进展、抗原递呈和免疫反应等相关的相互作用网络。这些结果显示Hp感染能够刺激颗粒富集的胞质结构(Particle-rich Cytoplasmic Structure PaCS)的形成,改变细胞基因表达过程,逃逸宿主防御机制,增加免疫和炎症反应,激活NFKB和Wnt/β-catenin信号通路,扰乱金属离子平衡,诱导癌症发生。(4)差异表达基因聚类分析能够将非Hp感染脾虚证患者和Hp感染脾胃湿热证患者分开。二、脾虚证患者、气虚证或体质人和脾虚大鼠模型物质能量代谢相关差异表达基因相似性比较(一)脾虚证患者两组芯片的物质能量代谢基因之间相似性比较1.两组芯片数据的GO分析都显示,脾虚证患者在涉及脂、蛋白质、核酸和糖代谢的相关基因表达异常,并且以参与蛋白质代谢的基因最多；KEGG分析都显示,脾虚证患者在参与蛋白质代谢通路的相关基因表达异常。2.两组芯片的分类对比分析显示,脾虚证与健康志愿者比较的物质能量代谢差异表达基因相对较少,主要涉及脂类、蛋白质、核酸和糖类代谢,而脾虚证与脾胃湿热证比较的物质能量代谢差异表达基因较多,主要涉及脂类、蛋白质、核酸、糖类、微量元素和能量代谢,并且两组芯片在具体的差异表达基因名称上也存在明显不同。尽管如此,两组芯片更多的存在很多共同点,表现在：(1)脾虚证患者在两组芯片中都存在大量物质能量代谢基因表达异常,占总差异表达基因的70%以上,并且大部分为酶基因或具有酶活性基因,总体以表达下调为主。(2)B3GNT1在两组基因芯片数据中都一致下调。(3)在代谢途径上,脾虚证患者在两者芯片中都表现为胆固醇代谢转化和脂肪酸p氧化过程降低,核糖体形成障碍,蛋白质翻译后磷酸化和糖基化修饰降低,蛋白质泛素化降解途径降低,DNA复制和转录水平低下,DNA损伤修复加强。同时,脾虚证患者胃肠道组织糖原合成降低,分解增强,并且还存在聚糖合成障碍。3.基于物质能量代谢基因差异表达的样本聚类分析显示,脾虚证患者与健康志愿者不能很好的分开,而脾虚证患者与脾胃湿热证患者则能很好的分开。(二)脾虚证患者物质能量代谢基因和气虚证或体质人物质能量代谢基因相似性比较脾虚证患者与其他气虚证或体质人物质能量代谢相关差异表达基因存在明显差异,具体表现在：(1)脾虚证患者,除与气虚体质人差异表达基因存在很多相似之处(差异表达基因都以下调为主,但是脾虚证患者在导致物质能量代谢障碍方面更加明显)之外,与其他气虚证或体质人在差异表达基因的种类、表达趋势和涉及的代谢途径上都明显不同；(2)UBA、ST、RAB和S100是脾虚证患者和气虚体质人的共有基因,可能与脾虚证密切相关,而RP、PTP和UBE2是脾虚证患者与其他气虚证或体质人的共有基因,可能与气虚证密切相关；(3)在代谢途径上,脾虚证患者参与糖、脂、蛋白质和核酸代谢的相关基因表达下调,而气虚证或体质人差异表达基因参与的代谢过程相对较少,并且相关基因以上调为主；(4)蛋白质泛素化异常是气虚证的共性,但脾虚证患者和气虚体质人表现降低,其他气虚证或体质人表现增强；(5)脾虚证患者和气虚证或体质人都存在DNA损伤,这可能是气虚证共有的病理现象。(三)脾虚证患者物质能量代谢基因和脾虚大鼠模型物质能量代谢基因相似性比较1.脾虚证患者和脾虚大鼠模型在差异表达基因的数量上存在明显差异,在表达趋势上,脾虚证患者差异表达基因总体以下调为主,脾虚大鼠模型差异表达基因除海马组织外,都以表达上调为主。这些结果说明脾虚证患者和脾虚大鼠模型在病理上可能存在明显不同。2.脾虚证患者和大鼠模型之间重复出现的代谢相关差异表达基因有13个：B3GNT1、CYP、SLC39A、SNX、FUT、SLC2A、GCNT、ACAD、LDH、RP、 PPP、S100和PTPR,其中RP和PTPR下调与气虚证患者共有基因分析结果一致；(1)这些基因表达产物,除RP外,全为酶和运载蛋白,与脾主运化的认识一致；(2)这些基因涉及糖、脂、蛋白质和微量元素代谢过程,具体表现为葡萄糖运输和分解、糖原合成与分解以及聚糖的合成紊乱；脂肪酸和胆固醇代谢异常；核糖体形成障碍、蛋白质翻译后磷酸化修饰降低和糖基化异常以及细胞内靶向输送增加；锌离子代谢增加、钙离子代谢降低。这些结果说明,不同建模方法构建的脾虚大鼠模型虽然都不能完全反映脾虚证的所有特征,但是都能从某一方面部分反映脾虚证的特征,其重复出现的代谢相关差异表达基因可能就是脾虚证的重要特征。三、脾虚证与脾胃湿热证对照的差异表达基因荧光定量PCR验证慢性胃炎非Hp感染脾虚证与Hp感染脾胃湿热证比较的差异表达基因HLA-DRB1、SCGN、COX7B和SULT1A4四个基因(后三个基因也是脾虚证与脾胃湿热证差异表达基因)的定量PCR结果与基因芯片实验结果一致,但是定量PCR结果整体比基因芯片结果偏低。此外,之前课题组对脾虚证患者与健康志愿者差异表达基因ACAA2进行了验证,定量PCR结果与基因芯片结果一致下调,定量PCR结果同样比基因芯片结果偏低。结论：1.脾虚证患者与其他气虚证不同,主要通过代谢相关基因,尤其是酶基因的表达下调,从而出现营养代谢障碍,具体表现为：(1)胆固醇代谢转化和脂肪酸β氧化过程降低；(2)核糖体形成障碍,蛋白质翻译后磷酸化和糖基化修饰降低,蛋白质泛素化降解途径降低；(3)DNA复制和转录水平低下,DNA损伤修复加强；(4)脾虚证患者胃肠道组织糖原合成降低,分解增强,并且还存在聚糖合成障碍。这些结果描绘出了脾虚证患者宏观物质能量代谢草图,支持《内经》中脾病理生理涉及物质能量代谢的论述,为脾藏象科学本质的现代研究和诠释提供了线索。同时,为从脾论治代谢性疾病研究提供了理论依据和学术指引。2.基于基因芯片数据分析获得的物质能量代谢相关差异表达基因与文献报道的临床代谢相关生化指标的测定结果相互印证,共同揭示了脾的病理生理主要涉及饮食物的消化吸收和体内代谢两方面。3.B3GNT1、ST、RAB、CYP、SLC39A、SNX、FUT、SLC2A、GCNT、ACAD、 LDH、RP、PPP1、S100和PTPR可能与脾虚证密切相关,而RP、PTP和UBE2可能与气虚证密切相关,这些基因为脾虚证的进一步研究提供了线索。4.基因表达谱分析显示,慢性胃炎脾虚证与脾胃湿热证之间临床表现差异较大,而慢性胃炎脾虚证与健康人之间临床表现差异不明显,这为中医疾病分型提供了理论依据。5.Hp感染会刺激PaCS的形成,改变细胞基因表达过程,逃离宿主防御机制,增加炎症和免疫反应,激活NFκB和Wnt/β-catenin信号通路,干扰金属离子的平衡,诱导肿瘤的发生。