研究目的:　　 阿尔茨海默病(Alzheimers disease，AD)，是一种以进展性认知功能障碍和记忆能力损害为特征的中枢神经系统退行性疾病，也是大脑变性疾病中最常见的疾病，多发于老年人，发病率随年龄的增加而增加。在65岁以上人群中，西方国家约有5％的人罹患此病，85岁以上老年人患病率高达47％～50％，我国在60岁以上人群中AD的患病率为3％～5％。在发达国家，AD已成为继癌症、心血管疾病、中风之后的第四大死因。我国从20世纪90年代起，提前进入人口老龄化的行列，60岁以上的老人已达1.26亿，占全国人口的10％，并以年均3.3％的速度上升。据估计到2025年我国60岁以上老年人将达2.8亿，占全国总人口的18.4％，届时将有1009万的AD患者。AD的病情呈进行性发展，但由于目前尚无特效的治疗药物或方法，患者通常在确诊后的3-9年内不治身亡。随着我国社会老龄化的日趋明显以及人均寿命的不断提高，AD对人类生命健康的威胁日益突出。　　 AD的病理学特征包括，大脑神经细胞外大量β-淀粉样蛋白(β-amyloidprotein，Aβ)沉积形成的老年斑、皮质神经细胞内tau蛋白异常聚集形成的神经原纤维缠结、皮质细胞减少、血管淀粉样变性、炎性浸润以及氧化损伤等。有关AD发病机制的学说众多，如蛋白异常学说、基因突变学说、突触失活学说、线粒体功能紊乱学说、炎症反应学说、钙平衡失调学说等。但到目前为止，其确切的病因及发病机制尚不清楚，一般认为是遗传和环境因素共同作用的结果，是一种多基因相关疾病，具有明显的家族聚集性，遗传因素在其发病中起重要作用。随着分子生物学的迅速发展及人类基因组计划的进行，寻找AD的遗传易感基因并从基因水平阐明其发病机制成为医学研究的热点。大规模筛查AD的遗传易感基因对于开展针对性的人群预防，延缓或防止AD的发生发展具有重要意义。　　 到目前为止，已有一些基因被证实与AD的发病密切相关，如21号染色体的淀粉样蛋白前体(amyloid precursor protein，APP)基因、14号染色体的早老素1基因（presenilin-1，PS-1）和1号染色体的早老素2基因（presenilin-2，PS-2）被认为与早发型家族性AD相关，而载脂蛋白Eε4(Apolipoprotein Eε4，APOEε4)被公认为与家族性和散发性AD都相关。　　 最近的研究表明，脑内细胞色素P450酶(cytochrome P450，CYP)及其底物和代谢终产物可能参与了AD等神经退行性疾病的发病过程。CYP为一类亚铁血红素-硫醇盐蛋白的超家族，在哺乳动物中主要存在于微粒体和线粒体中，参与大量的外源性物质（药物、化学毒物、致癌物等）和内源性物质（类固醇激素、维生素D、胆酸等）的代谢过程。在人类大脑，CYP参与的代谢途径中，至少有两条途径的多种内源性物质与AD的发病密切相关。第一条途径是胆固醇代谢及类固醇激素的生成途径。脑是体内胆固醇含量最高的组织，其胆同醇含量占人体总含量的20％，而脑组织本身只占人体质量的2％。胆固醇为合成神经细胞膜所必需，在髓鞘内含量很高，并形成脂质筏，后者是装配β和γ分泌酶及将APP加工为Aβ的平台。当酯化胆固醇过多时，膜脂转运减少，可致Aβ生成和聚集增多而清除减少，导致AD发生。由于胆固醇不能通过血脑屏障，必须通过CYP46A1将其代谢为24s-羟基胆甾醇才能与外周进行交流，因此，CYP46A1的功能状态直接影响了脑内胆固醇的水平，从而有可能参与了AD的发病过程。另外，胆固醇还可以在CYP11A1、CYP17A1、CYP19A1等一些关键酶的作用下，生成一系列与AD密切相关的类固醇激素，如妊娠素可以改善认知障碍，脱氢表雄酮(dehydroepiandrosterone，DHEA)可以促进神经元的存活和分化、同时还具有神经营养和保护作用，雌激素则具有防止神经元的死亡、选择性地增加神经元的可塑性以及减少Aβ在脑内的沉积等神经保护作用。因此，CYP11A1、CYP17A1和CYP19A1这些关键酶的表达及活性必然有可能通过影响了上述类固醇激素的生成，从而参与了AD的发生发展过程。　　 另外一条是花生四烯酸(Arachidonic acid，AA)经CYP表氧化酶途径代谢的通路。大量的研究表明，AD的发生发展通常伴随着慢性炎症反应，而CYP表氧化酶则能把体内的AA代谢成具有很强抗炎特性的环氧二十碳三烯酸(epoxyeicosatrienoic acids，EETs)，更重要的是，在AD患者的大脑中，其CYP表氧化酶的mRNA及蛋白表达水平比健康人群显著下降，因此，CYP表氧化酶的表达下降或功能缺失有可能参与了AD的发生发展过程。在人体内，参与EETs代谢的CYP表氧化酶主要有CYP2J2、CYP2C8和CYP2C9。除了CYP2C9并未见在脑内有表达的报道，CYP2J2和CYP2C8均在大脑的多个组织中有丰富的表达，其中大脑皮层、额叶和海马区的表达量最高，这些表达部位与AD患者脑内Aβ的分布相吻合。综上所述，本研究最终选取了参与胆固醇代谢及类固醇生成的关键酶CYP46A1、CYP11A1、CYP17A1和CYP19A1，参与AA代谢生成EETs的关键酶CYP2C8和CYP2J2，总共6个基因的12个多态性位点，然后采用病例-对照的方法，探讨这些基因多态性与中国汉族人群散发性阿尔茨海默病的相关性。此外，由于APOE基因ε4等位基因为目前所公认的散发型和迟发型阿尔茨海默症的危险因素，本研究打算选取该基因型作为分层因素，进一步探讨以上的CYP多态性位点与散发性AD的关系。　　 研究对象:　　 本研究在广州市老人院、广州市脑科医院和广州军区广州总医院收集散发性AD患者和健康对照者的外周血标本，共收集到AD病例组207个例，健康对照组256例，经统计学分析，AD组与健康对照组年龄和性别匹配，具有可比性。　　 1.AD受试患者入选标准:①年龄≥65岁，汉族，无血缘关系;　　 ②简易精神状态检查(MMSE)评分文盲≤17分，小学≤20份，中学及以上≤24分;　　 ③根据美国精神病学会的精神障碍诊断和统计手册第Ⅳ版(DSM-Ⅳ)标准(American PsychiatricAssociation2000)诊断有阿尔茨海默型的痴呆;　　 ④根据美国国立神经病、语言交流障碍和卒中研究所-老年性痴呆及相关疾病学会(NINCDS-ADRDA)的标准临床诊断为可能的AD患者。　　 排除标准:①血管性痴呆及系统性疾病和物质中毒所致的痴呆;　　 ②抑郁导致的假性痴呆;　　 ③合并其它神经系统疾病及脑血管疾病;　　 ④正处于心血管、肺、肝、肾等重大躯体疾病急性期的患者及恶性肿瘤患者。　　 2.健康对照者纳入标准:①年龄≥70岁，汉族，无血缘关系;　　 ②MMSE评分正常无痴呆;　　 ③无脑血管病及其它神经系统疾病;　　 排除标准:①确诊恶性肿瘤患者;　　 ②正处于心血管、肺、肝、肾等重大躯体疾病急性期的患者。　　 研究方法:　　 实验对象空腹8小时以上，静脉抽取5ml外周血置于EDTA-K2抗凝管中，按人血液DNA提取试剂盒操作步骤提取基因组DNA，然后采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术进行基因型分析。同时收集每一例受试者的总胆固醇(totalcholesterol，TC)、甘油三脂(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）和高密度脂蛋白胆固醇(high densityliprotein eholesterol，HDL-C)等相关的临床指标。　　 所有数据采用SPSS13.0统计软件处理，计量资料用均数±标准差（(x)±s）表示，采用双侧t检验比较AD组与对照组符合正态分布的计量资料;等位基因频率分布是否符合Hardy-Weinberg平衡定律、组间的基因型频率以及等位基因频率分析均采用x2检验，危险因素分析采用多元logistic回归分析;连锁不平衡(Linkage disequilibrium，LD)分析采用Haploview4.2软件，单体型分析采用PHASE2.0分析软件;以双侧P＜0.05为差异有统计学意义。　　 结果:　　 1.采用飞行时间质谱技术对207例散发性AD患者和239例健康对照者的基因组DNA进行ApoEε4(rs429358，rs7412)、CYP46A1(rs3783320，rs3742376)、CYP11A1(rs4887139, rs11638442)、CYP17A1(rs3824755, rs743572)和CYP19A1(rs3751592，rs1065778)基因分型，结果显示:①APOEε4基因型在AD组中的分布频率明显高于对照组，两组间具有统计学差异(P＜0.001)。②通过对各CYP亚型的基因型和等位基因分析，我们发现CYP17A1-rs3824755的基因型(GGvs.GC+CC)在AD组与对照组中的分布具有统计学差异(P=0.044)，表现为保护作用;CYP19A1-rs3751592的A等位基因和基因型(AAvs.AG+GG)在两组间的分布有统计学差异(P=0.042，P=0.036)，两者均增加了AD的发病风险。③当以是否携带APOEε4进行分层分析后发现，CYP17A1-rs3824755的G等位基因在APOEε4携带者的人群中对AD起保护作用(P=0.001);CYP17A1-rs743572的A等位基因在APOEε4携带者的人群中增加了AD的发病风险(P=0.037); CYP19A1-rs3751592的A等位基因在APOEε4携带者与非携带者人群中均增加了AD的发病风险(P=0.004，P=0.002)，同时，其基因型(AAvs.AG+GG)在APOEε4携带者的人群中也增加了AD的发病风险(P=0.006)。④在单体型分析结果中发现，CYP46A1的单体型G-C在两组中分布有统计学差异(P=0.050)，表现为保护作用。当以是否携带APOEε4进行分层分析，发现在携带ApoEε4的人群中，CYP46A1的单体型G-C和CYP17A1的单体型C-G对AD具有保护作用(P=0.038，P=0.001)，而CYP17A1的单体型G-A和CYP19A1单体型A-G则增加了AD的发病风险(P=0.037，P=0.004)。⑤采用logistic回归分析排除传统危险因素的影响之后发现，只发现ApoEε4为AD的风险因素，但未发现任何CYP的SNPs位点与AD发病存在相关性。　　 2.采用飞行时间质谱技术对206例散发性AD患者和256例健康对照者的基因组DNA进行ApoEε4(rs429358，rs7412)、CYP2C8(rs1058392，rs2275622)和CYP2J2(rs1155002，rs2271800)基因分型，结果显示:①APOEε4基因型在AD组中的分布频率明显高于对照组，两组间具有统计学差异(P＜0.001)。②通过对各CYP亚型的基因型和等位基因分析，我们未发现任何CYP的SNPs位点与AD发病存在相关性;而当以是否携带APOEε4进行分层分析后发现，在携带ApoEε4的人群中，CYP2J2-rs1155002的C等位基因和基因型(CC vs.CT+TT)在两组间的分布均有统计学差异(P=0.044，P=0.044)，并均表现为保护作用。③在单体型的分析中发现，CYP2C8的单体型C-T增加了AD的发病风险(P＜0.001)，而单体型T-C降低了AD的发病风险(P＜0.001);而在携带ApoEε4的人群中，CYP2C8的单体型C-T增加了AD的发病风险(P=0.009)，CYP2C8的单体型T-C和CYP2J2的单体型A-T则降低了AD的发病风险(P=0.023，P=0.044);在ApoEε4非携带者人群中，CYP2C8的单体型的发病风险与总体人群分析结果一致。　　 结论:　　 1.ApoEε4增加中国汉族散发性AD的发病风险。　　 2.CYP19A1-rs3751592的A等位基因和基因型(AA vs.AG+GG)增加了中国汉族散发性AD的发病风险。　　 3.CYP46A1(rs3783320，rs3742376)单体型G-C降低了中国汉族散发性AD的发病风险。　　 4.CYP2C8(rs1058932，rs2275622)单体型C-T增加了中国汉族散发性AD的发病风险，而单体型T-C降低了中国汉族散发性AD的发病风险。