【摘 要】
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目的:采用仿生纳米粒技术构建不同表型来源的巨噬细胞膜仿生纳米颗粒(记为PNP@MP),研究其对炎症细胞因子的吸附中和效果,同时评价其体内治疗作用及对PNP@MP的安全性进行研究,以期为多种致病因素导致的炎症细胞因子风暴提供可能的治疗策略。方法:采用超声乳化法制备聚乳酸-羟基乙酸共聚物(Poly(lactic-co-glycolic acid),PLGA)纳米颗粒,然后利用动态光散射仪及透射电镜检测
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目的:采用仿生纳米粒技术构建不同表型来源的巨噬细胞膜仿生纳米颗粒(记为PNP@MP),研究其对炎症细胞因子的吸附中和效果,同时评价其体内治疗作用及对PNP@MP的安全性进行研究,以期为多种致病因素导致的炎症细胞因子风暴提供可能的治疗策略。方法:采用超声乳化法制备聚乳酸-羟基乙酸共聚物(Poly(lactic-co-glycolic acid),PLGA)纳米颗粒,然后利用动态光散射仪及透射电镜检测PLGA纳米颗粒粒径、zeta电位及形态特征是否符合要求。将小鼠巨噬细胞Raw264.7(记为M0)诱导成M1和M2两种表型,然后使用流式细胞仪检测细胞表型以确定不同表型的巨噬细胞是否诱导成功。确认不同表型的巨噬细胞诱导成功后,按照同样的诱导方式诱导巨噬细胞,然后通过低渗冻融及梯度离心的方式提取诱导成功的不同表型来源的巨噬细胞膜,进而利用微型挤出器将分散于PBS中的细胞膜及PLGA进行梯度挤压以制备PNP@MP,通过动态光散射仪及透射电镜检测PNP@MP的粒径、zeta电位及形态特征是否符合要求。为了进一步研究制备的PNP@MP是否继承了细胞膜的生物学特性,我们通过免疫蛋白印迹法(Western blotting,WB)检测了其与源细胞表面膜蛋白的差异。随后我们将PNP@MP分别置于PBS和含有10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的PBS中观察72h以评估两者的膜稳定性差异。在确定PNP@MP继承了细胞膜的生物学特性及具有良好的稳定性后,我们开始检测PNP@MP对炎症因子的吸附能力,将PNP@MP与不同浓度的细胞因子共孵育后,超速离心移除PNP@MP并保留上清液,通过ELISA试剂盒检测上清液中剩余的细胞因子浓度。体内研究中,利用ds RNA类似物Poly(I:C)模拟病毒,构建BALB/C小鼠RNA病毒感染模型,建模成功后尾静脉给予PNP@MP治疗,8h后取小鼠血液处理得到血清,使用ELISA试剂盒检测血清中细胞因子的浓度,同样造模给药24h后取小鼠脏器HE染色来评估PNP@MP对组织器官的保护作用。最终通过血常规、生化指标及脏器HE染色评估PNP@MP体内的安全性。结果:动态光散射仪、透射电镜及WB的结果均表明PLGA纳米颗粒及PNP@MP的大小、zeta电位、形态及生物学特征均符合要求。流式实验结果显示M0表型为CD11b+F4/80+,M1的表型为CD11b+F4/80+CD86+,M2的表型为CD11b+F4/80+CD206+,意味着不同表型的巨噬细胞诱导成功。PNP@MP的稳定性实验结果显示两者溶液对PNP@MP的膜稳定性影响不大。体外细胞因子中和实验结果表明三种不同表型来源的PNP@MP对细胞因子均具有一定的中和效果,但不同来源的PNP@MP对不同的细胞因子中和效果有一定程度的差异。根据体外实验结果及体内模型建立情况我们选择M0型巨噬细胞膜来源的PNP@MP在小鼠体内进行一定的药效学研究,发现PNP@M0P可清除血清中炎症细胞因子,对机体炎症状态有一定的治疗效果,但未观察到明显的组织器官保护作用。体内的安全性评估表明小鼠各种检测指标均处于正常范围内,说明制备的仿生纳米颗粒具有安全性。结论:通过诱导不同表型的巨噬细胞来构建了不同表型来源的PNP@MP,在电镜、动态光散射仪及WB的实验结果均表明PNP@MP构建成功后,我们进行了体内外炎症细胞因子中和实验,结果表明PNP@MP能够有效降低多种炎症细胞因子水平,且PNP@MP具有安全性和稳定性,因此未来有希望成为细胞因子风暴的有效治疗手段。
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