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近年来,随着地震、海啸、恐怖袭击等创伤性事件频频发生,创伤后应激障碍(post traumatic stress disorder, PTSD)越来越受到研究者的关注。PTSD是指由于异常威胁性或灾难性心理创伤导致延迟出现和长期持续的精神障碍。Putnam的研究认为:68%的人一生中都会经历一次以上的重大精神创伤,遭遇精神创伤后7.8%～80%的人会发生PTSD而导致明显的甚至长久的心理痛苦。目前,临床上常用基于消退原理的暴露疗法治疗PTSD、恐怖症等疾病。但是,大约40%的患者暴露治疗效果不能维持,表现为已经消退的恐惧反应很快再现。因此,消退记忆长期保持机制的研究对于临床暴露疗法疗效的长期巩固维持具有重要的意义。海马是参与恐惧消退调节的重要结构。Corcoran等在消退训练之前,局部给予背侧海马muscimol(一种GABA能神经元抑制剂),最终导致已消退的恐惧行为再度出现(即消退习得受损),提示,海马参与了恐惧消退记忆的习得。此外,海马有大量的神经纤维投射到内侧前额叶皮层(medial prefrontal cortex,mPFC),海马-mPFC通路影响消退过程。电生理的研究显示恐惧消退与海马-mPFC通路突触效能的增加有关。Sandrine等在消退训练后,立即在腹侧海马给予低频电刺激损害海马-mPFC通路LTP,则损害了消退记忆。提示海马-mPFC通路LTP是消退记忆保持所必需的。细胞周期依赖性蛋白激酶5(Cyclin-dependent kinase 5,CDK5)是一种脯氨酸前导的丝氨酸/苏氨酸酶,主要存在于神经系统中。CDK5可以通过对多种底物的磷酸化过程,调节着突触的可塑性。2007年,Sananbenesi首次报道:海马CDK5通路可调节恐惧消退。他们在恐惧消退训练后1小时内,于海马微量注射CDK5抑制剂butyrolactone1,有利于消除特定环境造成的恐惧记忆,增加海马CDK5活性则恐惧会持续下去(损害消退记忆在海马的暂时储存)。然而CDK5是否参与消退长期保持过程,尚未见文献报道。恐惧消退是CS-NO US的联合学习,而突触结构的改变与学习记忆密切相关。Jing等对大鼠进行视觉训练后观察到视皮层神经细胞突触间隙减小,而突触后致密物质(postsynaptic density,PSD)增厚。张松筠等研究显示学习记忆能力减退时突触间隙增大。而条件性恐惧消退训练后海马突触结构的改变还未见文献报道。鉴于CDK5在恐惧消退中的作用以及突触结构改变与学习记忆的联系,本文做了如下研究:1.采用条件性恐惧消退模型,在消退训练后早期(7d内)不同时间点检测海马CDK5的表达及其酶活性变化情况。2.应用透射电镜观察条件性恐惧及消退后较长时间(7d和21d)海马突触的数量及其形态变化,以期能初步探索突触形态的变化与条件性恐惧及消退保持之间的内在联系。我们期望通过以上研究,能初步了解CDK5在条件性恐惧消退早期的变化、作用和可能机制,为CDK5作为临床治疗靶点的可能性提供实验依据,为PTSD的临床治疗提供基础实验资料。方法:1.将大鼠随机分为正常对照组,消退对照组(条件性恐惧建立后第二天,将大鼠置于实验箱中25min)和消退组(条件性恐惧建立后第二天,采用只给予声音,不给电击的方法进行消退训练,消退训练共需时间为25min),在消退训练后1d、3d、7d进行消退保持测试(只给予声音,需时10min),记录大鼠僵立时间,计算出不僵立时间百分比,即为消退保持成绩。并进行以下检测:①通过western blot检测消退训练后1d、3d和7d海马CDK5、P35和CDK5/P35的表达情况;②通过液闪法检测消退训练后1d、3d和7d海马CDK5酶活性变化;③通过免疫组化检测消退训练后1d、3d和7d海马CA1和CA3区的CDK5阳性细胞数变化。2.在消退训练后7d和21d进行消退保持测试,记录消退保持成绩。采用透射电镜观察消退训练后7d和21d时海马CA1区突触结构的变化。结果:1.实验一结果:①行为测试:在消退训练后早期,消退对照组和消退组大鼠在消退保持测试时,不僵立的时间整体均呈现逐渐增加的趋势。在消退训练后1d和3d,消退组和消退对照组的不僵立时间百分比均比正常组显著降低(p<0.01);在消退后7d,消退组的不僵立时间比消退对照组显著升高(p<0.01)。②CDK5表达:在消退训练后7d,消退组CDK5表达水平显著高于正常组和消退对照组(p<0.05);并且在消退组内,消退训练后7d显著高于3d(p<0.05)。③P35表达:与正常组相比,消退训练后7d,消退对照组和消退组P35表达水平均显著降低(p<0.01),而在消退训练后1d和3d无变化;并且在消退后各时间点,消退组与消退对照组相比均无显著差异。④CDK5/P35表达:消退训练后1d,消退组CDK5/P35表达显著高于正常组但低于消退对照组(p<0.05);消退训练后3d,消退组CDK5/P35表达显著高于正常组和消退对照组(p<0.05);消退训练后7d,消退组和消退对照组CDK5/P35表达均恢复至正常水平。⑤海马CDK5酶活性:消退训练后1d,消退组CDK5酶活性显著低于消退对照组(p<0.05);消退训练后3d,消退组CDK5酶活性显著高于正常组而低于消退对照组(p<0.01;p<0.05);消退训练后7d,消退组和消退对照组CDK5酶活性均恢复至正常水平。⑥海马CA1区CDK5免疫反应阳性细胞数变化:在消退训练后早期,消退组和消退对照组CDK5阳性细胞数均比正常组显著升高(P<0.01);且在消退训练后3d和7d,消退组比消退对照组显著升高(P<0.01;P<0.05);消退组内,CDK5阳性细胞数随时间显著增加。⑦海马CA3区CDK5免疫反应阳性细胞数变化:在消退训练后1d和3d,消退组与消退对照组海马CA3区CDK5阳性细胞数均显著高于正常组(p<0.01);并且在消退训练后1d时,消退组显著低于消退对照组(p<0.01)。消退训练后,消退组海马CA3区CDK5阳性细胞数逐渐增加,消退后3d最高,7d基本恢复正常。2.实验二结果:①行为测试:消退对照组消退保持成绩在消退训练后7d和21d均显著低于正常组和消退组(p<0.01;p<0.05),并且消退训练后21d显著高于消退训练后7d(p<0.05);消退组的消退保持成绩与正常组无显著差异。②突触数密度:消退训练后7d,消退组突触数密度显著高于消退对照组(p<0.05),而与正常组之间无显著差异;消退训练后21d,三组之间均无显著差异。③突触间隙宽度:消退训练后7d和21d,消退组突触间隙宽度显著低于正常组(p<0.01;p<0.05),而消退对照组与正常组之间无显著差异。并且在消退训练后21d,消退组突触间隙宽度显著低于消退对照组(p<0.05)。④PSD厚度:与正常组相比,消退训练后7d和21d,消退组与消退对照组PSD厚度均显著升高(p<0.01);且在消退训练后21d,消退组PSD厚度显著高于消退对照组(p<0.05)。⑤活性区长度:各组之间均无显著差异。结论:1.恐惧消退训练后,海马CDK5表达升高,而CDK5/P35的表达、CDK5酶活性均表现为先高于正常低于消退对照,后恢复正常。同时大鼠的僵立行为减少。提示恐惧消退训练后,海马CDK5的活性改变并不依赖于CDK5的蛋白表达变化,而是与CDK5/P35表达一致,并且低水平的CDK5的活性有利于消退记忆的长期保持。2.恐惧消退训练后,海马CA1区突触数密度增加、突触间隙变窄、PSD厚度增加,同时大鼠的僵立行为减少。提示恐惧消退训练后海马突触功能增强有利于消退记忆的长期保持。