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大肠杆菌表达系统是目前基因工程领域中应用最广泛、最成功的表达系统,具有遗传背景清晰明确、培养条件简单经济、生长迅速、质粒宿主种类多样性等特点。但在实际应用中,存在外源蛋白的表达效率不稳定,部分外源蛋白表达以不可溶性包涵体形式存在等问题。因此,寻找既能实现外源蛋白的高产量表达,又能尽可能使其以可溶形式表达的调控策略的探索具有广泛的应用前景。Tat(Trans-activator transduction)是人类免疫缺陷病毒-1(Human immunodeficiency virus-1,HIV-1)编码的富含碱性氨基酸的多肽,已知能介导多种外源物质通过各种膜性结构并保持生物活性。我们前期研究Tat碱性多肽穿膜效应时,首次发现Tat碱性多肽同样具有促进外源蛋白高产量及可溶性表达的新功能,并在国际上首次报道了该现象,但其潜在的作用机理尚不清楚。基于此,本文从以下几个方面开展相关研究:一、Tat碱性多肽促进不同分子量外源蛋白高产量、可溶性表达研究目的:研究HIV-1病毒编码的Tat碱性多肽促进不同分子量外源蛋白高产量、可溶性表达的普适性。方法:我们以线虫(C.clegans)、酵母(yeast)不同分子量(超小分子量、小分子量、中分子量、大分子量)靶蛋白作为研究对象,包括线虫超小分子量蛋白MTL-1(Metal-binding proteins-1,MTL-1)、MTL-2,线虫小分子量蛋白SOD-1(Superoxide Dismutase-1,SOD-1)、SOD-2,线虫中分子量蛋白GPD-3(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GPD-3)、酵母中分子量蛋白GAP-3,线虫大分子量蛋白DAF-16(Decay accerlerating factor-16,Daf-16)、HSP-70(Heat shock protein-70,HSP-70)。通过逆转录PCR(Reverse transcription PCR,RT-PCR)方法获得编码基因并成功构建含Tat标签与不含Tat标签的大肠杆菌原核表达载体,诱导剂异丙基β-d-硫代半乳糖甘(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导后采用SDS-PAGE技术检测诱导不同时间点(0 hrs、2 hrs、4 hrs、6 hrs)蛋白表达水平。结果:成功获得超小分子量、小分子量、中分子量、大分子量外源蛋白的含Tat标签和不含Tat大肠杆菌原核表达载体,聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)检测结果表明,Tat碱性多肽可促进小分子量蛋白(MTL-1、MTL-2、SOD-1、SOD-2)高产量、可溶性表达,促进中分子量蛋白可溶性表达,但对大分子量蛋白表达的促进作用不明显。同时,适用于不同物种(线虫、酵母)中低分子量外源蛋白的高产量、可溶性表达。结论:Tat碱性多肽可促进不同物种中低分子量外源蛋白高产量、可溶性表达,但对大分子量外源蛋白的表达促进作用不明显。二、Tat碱性多肽促进外源蛋白高产量、可溶性表达的潜在作用机理研究目的:研究HIV-1病毒编码的Tat碱性多肽促进外源蛋白高产量、可溶性表达的潜在作用机理。方法:我们以大肠杆菌超氧化物歧化酶SOD家族成员SOD-A、SOD-B、SOD-C作为研究对象,通过RT-PCR方法获得编码基因并构建含Tat标签与不含Tat标签的大肠杆菌原核表达载体,蛋白IPTG诱导后采用SDS-PAGE技术和蛋白质免疫印迹(Western blot)检测诱导不同时间点(0 hrs、2 hrs、4 hrs、6 hrs)蛋白表达水平。采用酶联免疫吸附实验(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测含Tat标签蛋白与不含Tat标签蛋白诱导不同时间点菌体的SOD总酶活变化,采用微生物全自动生长曲线仪检测诱导表达的Tat标签蛋白与不含Tat标签蛋白的抗百草枯(Parqual,PQ)活性,同时采用实时定量PCR技术(Quantitative real time polymerase chain reaction,q RT-PCR技术)检测含Tat标签蛋白与不含Tat标签蛋白菌体的信使RNA(Messenger RNA,m RNA)转录水平。进一步地,采用亲和层析技术分离纯化含Tat标签蛋白和不含Tat标签蛋白,利用圆二色谱(Circular dichroism,CD)分析仪检测含Tat标签蛋白与不含Tat标签蛋白的二级结构变化。结果:成功获得大肠杆菌SOD-A、SOD-B、SOD-C含Tat标签和不含Tat大肠杆菌原核表达载体,SDS-PAGE和Western blot检测结果表明,Tat碱性多肽可以促进SOD-A、SOD-B、SDOC高产量、可溶性表达;ELISA和微生物生长曲线检测结果表明,含Tat标签蛋白的诱导表达蛋白菌体的总酶活显著高于非Tat标签蛋白;且Tat标签蛋白诱导表达菌体的抗PQ活性显著高于非Tat标签蛋白,特别是Tat-SOD-A和SOD-A组之间存在显著性差异;q RT-PCR结果表明,含Tat标签蛋白的m RNA转录水平显著高于不含Tat标签蛋白;圆二色谱法测定结果表明,Tat标签蛋白的α-螺旋比例和β转角显著增加,β-转角折叠比例显著减少。结论:Tat碱性多肽通过增加m RNA转录水平促进大肠杆菌SOD系列蛋白外源蛋白高产量、可溶性表达,含Tat标签蛋白的菌体具有明显的生物酶活及抗PQ活性,其中SOD-A基因在抗PQ活性发挥重要作用;且Tat标签蛋白的二级结构发生显著改变。三、Tat碱性多肽促进外源蛋白4℃高产量表达的研究目的:研究HIV-1病毒编码的Tat碱性多肽促进外源蛋白4℃高产量表达的作用机理。方法:我们以大肠杆菌增强型绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein,EGFP)和脑红蛋白(Neuroglobin,NGB)作为研究对象,通过RT-PCR方法获得编码基因并构建含Tat标签与不含Tat标签的大肠杆菌原核表达载体。4℃低温条件下IPTG诱导后采用SDS-PAGE和Western blot检测IPTG诱导144 hrs后,含Tat标签蛋白与不含Tat标签蛋白表达水平。随后,采用SDS-PAGE、Western blot和荧光显微镜检测IPTG诱导不同时间点(0 hrs、24 hrs、48 hrs、72 hrs、96 hrs、120 hrs、144 hrs),Tat标签蛋白与不含Tat标签蛋白表达水平。最后,采用荧光显微镜观察4℃不含IPTG诱导后,Tat标签蛋白与不含Tat标签蛋白单克隆泄露表达水平变化。结果:成功获得大肠杆菌EGFP、NGB含Tat标签和不含Tat大肠杆菌原核表达载体,SDS-PAGE和Western blot检测结果表明,Tat碱性多肽可以促进4℃诱导表达144 hrs后蛋白高产量、可溶性表达;随着诱导表达时间增加,含Tat标签蛋白的蛋白表达产量逐渐升高。在不加IPTG诱导剂的情况下,含Tat标签蛋白的泄露表达产量显著高于非Tat标签蛋白。结论:Tat碱性多肽可促进外源蛋白4℃高产量表达,且表达产量随着诱导时间的增加而显著提高。在不加IPTG表达下,Tat碱性多肽促进外源蛋白泄露表达,且表达产量随着诱导时间的增加而显著提高。