Decorin抑制脉络膜/视网膜新生血管的实验研究

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目的:脉络膜、视网膜新生血管形成是眼底病患者视力损害的主要原因。缺氧导致的血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)分泌增高,促使血管内皮细胞增殖、迁移是眼底新生血管形成的共同病理特点,但目前尚缺乏安全有效的治疗方法。如何抑制低氧条件下VEGF的过量分泌是治疗脉络膜视网膜新生血管的关键。Decorin是一种小分子富含亮氨酸的蛋白聚糖,对细胞表面多种受体酪氨酸激酶具有拮抗作用,但能否调控眼底新生血管的形成尚不明确。本课题首先检测decorin对人视网膜色素上皮细胞(ARPE-19)低氧条件下分泌VEGF的影响及可能机制;然后构建携载decorin编码基因的慢病毒载体转染ARPE-19细胞,并与脉络膜视网膜血管内皮细胞(RF/6A)共培养,检测转染的ARPE-19细胞低氧条件下对RF/6A细胞血管生成能力的影响;最后,构建携载decorin编码基因的自身互补型腺相关病毒载体,建立小鼠氧诱导视网膜病变模型,在体观察decorin对视网膜新生血管的抑制作用。方法:(1)体外实验部分:首先应用CCK-8和ELISA法明确decorin抑制ARPE-19细胞低氧条件下VEGF过量分泌的合适浓度(50nM);之后分别应用western blot和荧光定量PCR法检测decorin50nM预处理后ARPE-19细胞低氧下3,6,12和24h Met、Rac1、低氧诱导因子-1α(hypoxia-induciblefactor-1alpha,HIF-1α)及VEGF的蛋白和mRNA表达;然后利用小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)沉默ARPE-19细胞的Met基因,探讨decorin抑制ARPE-19细胞低氧条件下VEGF过量分泌的可能机制;最后,利用重组DNA技术构建携载decorin编码序列的慢病毒载体,转染ARPE-19细胞,并将其与RF/6A细胞共培养,检测转染的ARPE-19细胞低氧下对RF/6A细胞增殖、迁移和管腔形成能力的影响。(2)体内实验部分:构建携载decorin编码序列的自身互补型腺相关病毒载体(scAAV2-CMV-decorin)并验证;在C57/BL6小鼠出生后7d,玻璃体腔注射1μl病毒载体,之后放入75%氧仓饲养5d,再放入常氧仓饲养5d后取材,视网膜铺片isolectin染色测量视网膜新生血管面积变化,荧光定量PCR法检测视网膜HIF-1α和VEGF mRNA的表达,western blot检测视网膜decorin和HIF-1α蛋白的表达,ELISA检测视网膜VEGF的分泌。结果:(1)细胞部分:ARPE-19细胞低氧后Met,Rac1,HIF-1α和VEGF的mRNA和蛋白表达呈时间依赖性增高,此效应可被重组人decorin50nM显著抑制;ARPE-19细胞转染Met siRNA后低氧条件下Met,Rac1,HIF-1α和VEGF的mRNA和蛋白表达亦明显降低,且Met siRNA转染组和decorin处理组的表达没有统计学差异;转染携载decorin编码序列的慢病毒载体后,ARPE-19细胞显著表达分子量40KD的decorin核心蛋白,低氧条件下可明显抑制共培养的RF/6A细胞的增殖、迁移和管腔生成能力。(2)动物部分:成功构建scAAV2-CMV-decorin病毒载体及建立C57小鼠氧诱导视网膜病变(oxygen-induced retinopathy,OIR)模型,OIR小鼠出生后17d,scAAV2-CMV-decorin病毒注射组与对照组相比,视网膜高表达分子量40KD的decorin核心蛋白,且视网膜新生血管面积明显减少,VEGF和HIF-1α的表达显著下降。结论:Decorin可通过拮抗Met受体,下调Rac1和HIF-1α的表达,进而抑制ARPE-19细胞低氧条件下VEGF的过量分泌;ARPE-19细胞decorin过表达在低氧条件下可明显抑制脉络膜血管内皮细胞的血管生成能力;玻璃体腔注射携载decorin编码序列的scAAV载体可以明显抑制C57小鼠氧诱导视网膜病变新生血管的生成。
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