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流感病毒属于正黏病毒科(Orthomyxoviridae)流感病毒属,是威胁人类健康的主要病原体之一,接种疫苗是预防流感发生和传播最有效的手段。传统的流感疫苗以鸡胚作为生产介质,存在外源因子污染,鸡胚供应周期长等弊端,特别是当禽流感暴发流行时,造成鸡群的大量死亡,难以满足大规模生产需求。非洲绿猴肾细胞系(Vero)是WHO推荐使用的人用疫苗生产介质,研究证实流感病毒可获得在Vero细胞上的适应性。但传统Vero细胞培养需要使用血清,血清成分复杂,培养病毒后在病毒的收获液中残留的血清会增加病毒纯化的难度。同时,Vero细胞培养流感病毒时,缺乏HAO裂解酶,需要加入外源性胰酶,而血清会抑制胰酶的活性,影响细胞培养流感病毒的产量。如果使用无血清Vero细胞培养流感病毒则可以避免这些不足之处,Vero细胞无血清培养基的开发将实现流感疫苗高效率的生产,是细胞流感疫苗研发的重要环节。目前商品化的无血清培养基都是针对某一细胞株的营养需求进行开发的,不同的细胞其无血清培养基成分也不同。本试验中采用逐步降低血清的方法对血清依赖的Vero细胞进行无血清适应,无血清适应后的Vero细胞(Serum Free Medium-Vero, SFM-Vero)使用不同的无血清培养基进行培养。分别使用自制的低动物源蛋白无血清培养基(SFM-1)和无动物源蛋白无血清培养基(SFM-2),与商品化的无血清培养基(VP-SFM、OptiPROTM SFM、EX-CELLTM VERO、VirusProTM ERO)同时培养SFM-Vero细胞。通过细胞形态、细胞增殖速率等方面进行比较,商品化的无血清培养基VP-SFM和自制的SFM-1、SFM-2能够维持SFM-Vero细胞稳定地增殖和传代。SFM-Vero细胞在SFM-1无血清培养基中培养至96 h时葡萄糖消耗平均为11.306mM,与普通血清培养基接近,说明培养基中的血清替代物能够很好地刺激细胞对葡萄糖的利用；培养过程中氨的积累浓度平均为4.8 mM,在合理范围内,未出现氨浓度过高抑制细胞生长和代谢。SFM-Vero细胞培养H5N1亚型流感病毒中,采用Box-Behnken design方法对pH、MOI和TPCK-Trypsin浓度进行了优化,结果显示它们的响应面图都呈马鞍型,表明响应值有极大值；根据响应面和等高线趋势,进一步确定得到病毒培养的较优培养条件为：pH7.64, TPCK-Trypsin浓度0.68μg/mL, MOI 0.01。在该条件下培养的流感病毒HA滴度可达768 HAU/50μL,是正常血清Vero细胞培养H5N1的1.5倍。此外,试验还对影响SFM-Vero细胞培养H5N1亚型流感病毒产量的重要因素：细胞胞龄、培养温度、补加TPCK-Trypsin进行了相关研究,结果为选择培养36 h胞龄的SFM-Vero细胞接种流感病毒H5N1后,HA值和TCID50最高,平均分别为512 HAU/50μL和7.708 1gTCID50/mL;病毒培养温度上,33℃病毒的产量最高,相应的HA值和TCID50也最大,平均分别为576 HAU/50μL和7.8331gTCID50/mL；同时病毒培养过程中,24 h后是否补加初始浓度的TPCK-Trypsin对病毒的产量影响大。H5N1亚型流感病毒在SFM-1培养基培养的SFM-Vero细胞上连续传代,结果显示病毒的血凝素(HA)滴度和TCID50保持稳定,平均分别为435.2 HAU/50μL和7.85 1gTCID50/mL；对连续传代第5代、10代、15代的A/Anhui/1/2005(H5N1)va病毒HA和NA基因片段的序列分析,病毒两个表面抗原基因没有发生突变。