中药质量问题一直是我国中医药行业存在的重大问题。中药的真伪将直接影响其临床疗效。中药材的产地来源、种植方法、存储时间和用药部位等问题都会影响中药材的质量问题。因此更加客观、快速、准确的鉴别中药材的来源和掺伪等问题尤为迫切。傅里叶变换红外光谱法(Fourier Transform infrared spectroscopy)既无污染、操作简便快速、样品用量小,又可以真实地反映中药的整体信息,而不单单是指标成分的信息。辅以化学计量学(chemometrics)更能够实现复杂样品的快速高通量分析。研究目的:本实验以贵重中药川贝母和大宗常用中药当归为研究对象,采用红外光谱技术与化学计量学相结合的方法,整体系统地讨论红外光谱法在中药质量评价中的应用,为中药质量标准化的建立提供数据支撑。研究方法:1.采用傅立叶变换近红外光谱(FT-NIR)和反射光纤探针,对不同种类的贝母鳞茎直接进行检测和自动鉴别,通过主成分分析和聚类分析,建立贝母鳞茎的软独立建模分类法(SIMCA算法)的监督模式识别模型。2.通过傅里叶变换红外光谱(FT-IR)对川贝母粉末及其醇提物进行一维红外光谱、二阶导数红外光谱和二维红外光谱,层级递进,解析贝母药材的复杂体系。针对川贝母粉末的真伪鉴别问题,将浙贝母、伊贝母、平贝母以5%、10%、20%、30%、40%、50%比例掺杂于川贝母粉末中,基于SIMCA算法的监督模式识别建立贝母粉末掺假模型,采用验证样品的预测值对所建模型进行评价。通过偏最小二乘算法(PSL)建立贝母粉末掺假比例的多变量校准模型,根据决定系数和预测标准差对模型参数进行优化。3.进行了贝母粉末的显微光谱特征分析,通过主成分分析和归一化相对峰强度法的计算,寻找川贝母与其他贝母粉末的显微红外光谱差异特征。4.利用傅里叶变换红外光谱对当归饮片进行了经典红外光谱分析与二阶导数分析。研究结果:1.贝母鳞茎近红外光谱与淀粉光谱相似,川贝母的C-H伸展和弯曲吸收峰在4320cm-1以下,但伊贝母、浙贝母和平贝母中在此处的吸收峰在4320cm-1以上;川贝母中O-H拉伸和C-O伸缩的吸收峰出现在4760cm-1附近;但伊贝母,浙贝母和平贝母中的这些带接近4750cm-1;川贝母中O-H伸展吸收峰(6820～6790cm-1)也出现在比其他种类贝母更高的波数处,这表明川贝母和其他种类贝母中含有不同的C-H、O-H和C-O基团。二阶导数近红外光谱中,伊贝母,浙贝母和平贝母在4860cm-1附近的峰值通常高于4750cm-1附近的峰值,川贝母只有4750cm-1处吸收峰;4860cm-1附近的吸收峰可归属于N-H拉伸和蛋白质酰胺II的组合带,而4750cm-1附近的峰可归属于碳水化合物的O-H拉伸和C-O伸缩组合带;这意味着伊贝母,浙贝母和平贝母含有比川贝母更多的蛋白质。使用在6000～4000cm-1范围内的二阶导数近红外光谱进行主成分分析,第一主成分能区分川贝母和其他种类的贝母。第二主成分将伊贝母与浙贝母和平贝母分开,而第三主成分能区分浙贝母和平贝母。再将不同种类的贝母进行SIMCA聚类分析,使用SNV校正后7400～4400cm-1范围内的近红外光谱,SIMCA模型的可靠性为99%,而分数扩展因子为1.5,残差扩展因子为1.3。2.(1)川贝母粉末的红外光谱分析:经典红外光谱中,根据1460cm-1、1372cm-1,1162cm-1和1082cm-1处吸收峰强度可以区分野生品(炉贝母、青贝母和松贝母)和栽培品(太白贝母和瓦布贝母)。二阶导数光谱中,贝母野生品在1338cm-1附近吸收峰比1301cm-1处强度高,而贝母栽培品两峰的高度一致;二维光谱中,炉贝母、青贝母和松贝母的最强自动峰均在950cm-1附近,太白贝母在891cm-1和908cm-1附近,而瓦布贝母在990cm-1附近。川贝母粉末醇提物中,野生品在1800～1200cm-1范围内的吸收峰低于1200～800cm-1范围内的吸收峰,而栽培品在1800～1200cm-1范围内的吸收峰明显高于1200～800cm-1范围内的吸收峰。在贝母醇提物二阶导数红外光谱中,2000cm-1～1200cm-1范围炉贝、青贝和松贝醇提物在1570～1510cm-1范围内,栽培品和野生品的峰形有明显的区别,栽培品最强峰是1514cm-1,而野生品最强峰是1561cm-1。醇提物的二维光谱中,栽培品太白贝母和瓦布贝母的最强自动峰出现在1050cm-1和990cm-1附近,其中太白贝母在967cm-1和1069cm-1两自动峰对应的交叉峰为正,并且他们之间形成明显“井”字形峰簇。(2)贝母粉末掺伪红外光谱分析:经典红外光谱中,在1650cm-1附近的川贝母的吸收峰低于1464cm-1附近的峰,而其他种类贝母在1650cm-1附近的吸收峰相等达到或高于1464cm-1附近的峰值。此外,在其他贝母的光谱中可以观察到1515 cm-1附近的弱峰。在1650cm-1附近的吸收峰是O-H弯曲吸收带、芳香骨架带和酰胺Ⅰ带的重叠,1515cm-1附近的吸收峰可以认为是芳香骨架带和酰胺Ⅱ带的重叠,在1464、1420和1372cm-1附近的吸收峰主要是C-H弯曲带;上述光谱差异表明,伊贝母、平贝母和浙贝母含有比川贝母更多的蛋白质和芳香族化合物。随着掺杂物的增加,1650cm-1附近的掺杂川贝母粉末的吸收峰值变得更强。同时,1515 cm-1附近的吸收峰越来越明显。上述结果表明,根据经典红外光谱特征在1800～1200cm-1范围内,可以区分不同品种的川贝母及其掺伪样品。本研究首次定义整合二维相关谱是同步和异步二维相关谱的相乘谱,川贝母掺伪粉末的整合二维相关谱比异步相关谱显示更明显的差异。在1200～1OOOcm-1区域,川贝母显示一对吸收峰交叉带,但川贝母掺伪粉末显示两对吸收峰交叉带。此外,随着掺杂比例的增加,接近1400cm-1和1650cm-1附近吸收峰的交叉峰变得更强。整合二维相关谱可以比同步或异步相关谱更直观地识别川贝母掺伪样品。经过SIMCA聚类分析,使用SNV校正后1800～1200cm-1范围内的FT-IR光谱,SIMCA模型的可靠性为99%,而分数扩展因子为1,残差扩展因子为0.5,识别真实川贝母的总距离阈值为2.024。除了 95%青贝和5%平贝母的混合物以外,不同种类贝母及所有掺伪样本都可以被正确识别为是否为川贝母。预测PLS模型的决定系数(R2)为0.987,而预测标准差(SEP)为 0.035。(3)贝母粉末的显微光谱中,不同种类贝母粉末的显微红外光谱,前三个主成分得分而生成不同颜色的彩色图像,具有相似光谱特征的像素在不同主成分上的得分接近,贝母粉末中至少存在三类具有独特光谱特征的像素,第一类像素的光谱特征与淀粉光谱特征是一致的,对应于贝母粉末中的淀粉粒。第二类像素在第二主成分上得分较高,该类像素的光谱特征主要是1640 cm-1和1530 cm-1附近的蛋白质酰胺Ⅰ带和酰胺Ⅱ带吸收峰,对应于贝母粉末中的糊粉粒等富含蛋白质的微观结构。第三类像素在第三主成分上得分较高,包含1735 cm-1附近的C=O伸缩振动吸收峰、1200～900 cm-1区域的C-C伸缩振动、C-O伸缩振动和糖环骨架振动吸收峰,来自构成细胞壁的纤维素、半纤维素和木质素类成分,伊贝母、平贝母和浙贝母中在1700～1500 cm-1区域的吸收峰较强,说明蛋白质和细胞壁的含量相对高于川贝。计算川贝母粉末样品的相对峰强度,Rm值稳定在0.70左右,标准差为0.01;伊贝、平贝和浙贝Rm值稳定在0.49左右,标准差为0.07,能明显区分不同种类的贝母。3.不同产区、储存时间和不同部位当归的红外分析:(1)不同产区当归:在1068cm-1和1053cm-1的O-H弯曲伸缩振动峰处吸收峰高度不同,岷县和渭源县在两处吸收峰相对高度有明显差异,1068cm-1吸收峰高于1053cm-1处吸收峰;而漳县在此处吸收峰差别不大。二阶导数光谱中1514cm-1附近是芳香环伸缩振动吸收峰,此处吸收峰相对强度:漳县>渭源县>岷县。1476cm-1和1460cm-1附近是C-H弯曲伸缩振动峰对应酯类分子,次处吸收峰相对强度:渭源县>岷县>漳县。(2)不同储存时间的当归:储存1年的当归在 1746cm-1、1068cm-1、1053cm-1 990cm-1、920cm-1、867cm-1 处吸收峰整体上较储存2年的当归相对吸收峰强度大,验证糖类和糖苷类物质随着储存时间的增长逐渐减少。二阶导数光谱中,储存1年的当归在1476cm-1C-H弯曲振动吸收峰强度略高于储存2年的当归,属于油脂类特征吸收峰,说明随着储存时间的增加当归中挥发油的含量变小。(3)不同部位的当归:在1500～1200cm-1范围内,吸收峰数目当归尾较多。从吸光度大小来看,当归不同药用部位中,红外吸收的化学成分含量大小依次是:当归尾>当归头和全当归。二阶导数1800～1200cm-1范围内,1476cm-1和1460cm-1吸收峰相对强度分别是当归尾>当归头>全当归,全当归在1408cm-1处吸收峰低于1385cm-1处吸收峰,而当归头和当归尾1385cm-1吸收峰强于1408cm-1强度。