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启动子是生物体自身基因表达调控的重要元件,也是基因工程表达载体的一个重要元件。从生物体中分离、研究启动子,不仅可以让人们更深入地了解生物生长发育的分子机理,同时也为基因工程提供了各种不同功能的启动子,促进基因工程的发展。
细胞分裂素是一类具有与N6-呋喃甲基腺嘌呤相似结构的,能够促进细胞分裂与分化的物质。植物体内大量存在着无活性的结合态细胞分裂素,有生物活性的只占少部分。因此,植物体内对于细胞分裂素水平的控制是个非常精细而又重要的过程。玉米体内活性细胞分裂素的水平主要受活化细胞分裂素的β-葡萄糖苷酶和降解细胞分裂素的细胞分裂素氧化酶控制。因此,分离这两类基因的启动子并研究它们的表达特性,不仅对于研究玉米的生长发育控制具有重要的理论意义,也可为植物基因工程提供有潜在应用价值的启动子。
本试验用部分ZmGLU1cDNA序列标记探针去筛选玉米基因组文库。经过四轮的筛选得到了7个阳性克隆,选择其中一个克隆进行酶切分析,回收XbaⅠ和Sa1Ⅰ双酶切产生的一条约4kb的阳性片段进行亚克隆和测序。测序结果表明该片段包含1904bp的Z~LU1基因5侧翼序列。对该序列进行5端缺失,得到9条不同长度的片段。将这9个片段插入到真核表达载体pCAMBIA3301中替换35S启动子,从而得到了9个植物表达载体:D0(-1677)、D1(-846)、D2(-798)、D3(-758)、D4(-717)、D5(-679)、D6(-530)、D7(-315)和D8(-82)。通过农杆菌介导的方法将这些载体转化烟草,对转基因烟草植株不同的组织和器官进行GUS组织化学染色和荧光定量检测。结果表明:(1)全长启动子D0(-1677)是个强表达活性的启动子,在大部分器官中的活性是35S启动子的一半左右。在根中的活性最强,约是35S启动子的3倍。在成熟种子中的活性最低,只有35S启动子的二十分之一。GUS染色主要集中在维管组织中。(2)全长启动子D0(-1677)的活性在开花后10天内变化不明显,维持很高水平,10天后活性急剧下降,到35天的时候下降到非常低的水平,大概是开花期的五十分之一。而随着种子的萌发,启动子活性又很快升高,其中在第3天和第8天增幅最大,这两个时间段分别是胚根和胚芽的出现时间,萌发11天后的幼苗中GUS活性达到最高,大约是成熟种子的300倍。(3)全长启动子D0(-1677)不响应冷、涝、旱和盐四种逆境,受到NAA、6-BA和反-玉米素的抑制调节,抑制响应元件在-530bp至-315bp之间。(4)当从-798缺失至-758时,启动子失去根的组织特异性,成为组成型强表达启动子。
另外,本试验还克隆了ZmCKX1和ZmCKX25侧翼序列。将这两个片段构建到pCAMBIA3301载体上并转化烟草,GUS活性分析表明:ZmCKX2P5侧翼2kb序列具有启动子活性,但活性非常弱。ZmCKX1P5侧翼1.5kb序列具有启动子活性,是ZmCKX2P的10多倍;并且在种子萌发过程中活性变化不明显。