论文部分内容阅读
目的：观察并比较人脂肪干细胞(human adipose-derived stem cells, hASCs）、脂肪干细胞条件培养基（human adipose-derived stem cells-conditioned medium,hASCs-CM）和大鼠成纤维细胞（dermal fibroblast, DF）对皮肤烧伤的修复作用，寻找脂肪干细胞修复皮肤作用中的关键分子和可能的干预因素。方法：1.利用胶原酶消化法对ASCs进行分离培养，绘制细胞生长曲线；应用流式细胞仪对P2、P3、P5的ASCs进行表面标志物检测；应用诱导分化培养基对ASCs向成脂、成软骨和成骨方向进行诱导分化，分化后分别行油红O、阿尔辛蓝和茜素红特殊染色鉴定；应用免疫荧光技术和PT-PCR技术对P1、P2、P5、P6细胞中Oct4和Sox2的表达情况进行分析。2.收集获得正常、高碳酸和TGF-β1诱导三种培养条件下的hASCs-CM，检测hASCs-CM中分泌的多种生长因子VEGF、bFGF、 IGF-1和EGF。数据采用SPSS17.0统计软件进行方差分析。3.胶原酶P消化法培养新生小鼠真皮层成纤维细胞，并进行传代、冻存和复苏。4.选用200±20g的SD大鼠，建立III度烧伤模型。随机分为盐水对照组、MDF移植对照组、hASCs组、hASCs-CM组检测大鼠皮肤损伤修复情况。同时在7d、15d、21d和28d采集标本，并进行拍照。行HE染色观察大鼠烧伤皮肤组织的病理结构，通过图像分析软件比较创面愈合率。5.用抗人线粒体抗体检测烧伤组织中人线粒体表达，进一步了解hASCs在损伤组织的分布情况。分别采集7d、15d、21d和损伤皮肤用免疫组化方法检测MMP1、MMP9、III、Ⅳ型胶原蛋白的表达情况，并用IPP6.0软件测OD值进行半定量分析，结果采用SPSS17.0软件进行方差分析。结果：1.原代及传代培养ASCs呈成纤维样贴壁生长，形态均一，细胞群体倍增时间为31h。各代ASCs均表达CD29、CD44、CD90和CD105，不表达CD34和CD45，也不表达CD8a、CD56和CD69；成脂、成软骨和成骨诱导后染色鉴定结果均为阳性；Oct4在P1、P2细胞中的表达位于细胞核内,而在P5、P6细胞的表达则位于胞质；Sox2在P1、P2细胞的胞质中表达，而在P5、P6细胞的胞质中几乎不表达。Oct4随着传代次数表达是逐渐减少的，Sox2在P1、P2细胞中可检测到RNA的表达，P5、P6细胞中无RNA表达。2.与正常对照组比较，高碳酸环境组和TGF-β1组的ASCs-CM的VEGF、EGF、bFGF和IGF-1的含量明显增多，差异具有统计学意义（P <0.01）；TGF-β1组与高碳酸环境组的VEGF、bFGF和IGF-1相比，差异具有统计学意义（P <0.01），EGF组差异无统计学意义（P=0.086）。3.新生小鼠背部皮肤经酶消化法后12-36h有贴壁细胞。细胞呈短梭形、多角形或不规则形。2～3d后细胞数量迅速增加成75%-90%汇合，传代细胞逐渐变为长梭形，胞质向外伸出伪足，细胞核呈卵圆形，居中。传代后细胞形态较为均一，排列规则，呈平行状、放射状、旋涡状生长。4.统计烧伤创面的愈合率，结果表明细胞移植14d后，ASCs移植治疗组的愈合率为47.63%与ASCs-CM组(40.18%)、MDF组(37.85%)和盐水对照组（31.83%）相比具有统计学差异（P<0.05）。在21d和28d与盐水组相比，ASCs-CM组和DF组有一定的促进作用。ASCs移植组的皮肤愈合速度最快，肉芽组织成熟，胶原排列整齐，毛细血管较少，皮肤结构层次较清晰，且表面有毛长出。这提示ASCs在烧伤修复中有着很强的促进作用。5.随着时间的推移，ASCs主要分布在创面。ASCs组在14d和21d III型胶原的表达量高于其他组，但7d时的表达量与其他组无统计学差异。ASCs组在14d和21d MMP1的表达量高于其他组，但7d时的表达量与其他组无统计学差异。不同时间点各组的Ⅳ型胶原表达量较少，差异无统计学意义。各组不表达MMP9。结论：1.通过对脂肪干细胞（ASCs）的原代及传代培养，研究了多能性分子Oct4和Sox2在ASCs中的表达，为ASCs的优化培养提供了线索和依据。2.在高碳酸环境和TGF-β1诱导下，ASCs-CM中的生长因子含量均升高，而TGF-β1作用更明显，对ASCs-CM应用于临床提供了理论依据。3. ASCs移植组的皮肤愈合速度最快，皮肤结构层次较清晰，且表面有毛长出。这提示ASCs在烧伤修复中有着很强的促进作用。4. ASCs通过上调III型胶原和MMP1的表达，减少Ⅰ型胶原的合成和瘢痕形成，改善了Ⅰ/III型胶原的比例，促进烧伤的修复，为后续研究提供了思路和线索。5.在烧伤修复的早中期，各组表达少量的Ⅳ型胶原，不表达MMP9。由于Ⅳ型胶原在表皮功能的重塑和瘢痕形成中有着重要的作用。后续研究中可延长时间观察其变化，进一步了解其在烧伤修复中的作用。