论文部分内容阅读
近年来，肺癌发病率和死亡率呈逐年上升趋势，已成为严重威胁人类生命健康的癌症第一杀手，急需新的防治措施来改善。药物免疫疗法是本世纪肿瘤治疗领域的重大突破，与直接靶向肿瘤细胞的传统化疗药物相比，其突出的特点是通过重储患者免疫能力消除肿瘤，有低毒高效治疗肿瘤的优势。目前，癌症免疫疗法的手段有激活先天性和继发性免疫。先天免疫是第一道防线，主要负责提呈抗原，也有部分直接清除病原体作用。继发性免疫能够特异性识别抗原，产生强烈的免疫反应，是清除病原体的主要途径，但如果缺乏一线免疫的辅助，其免疫反应难以持久。巨噬细胞作为肿瘤微环境中最丰富的一线免疫细胞，在不同环境下可以极化为两种表型：抗肿瘤M1巨噬细胞和促肿瘤M2巨噬细胞。在肿瘤微环境中，肿瘤浸润性巨噬细胞(TIMs)通常表现为M2型，有刺激肿瘤新生血管形成、诱导免疫细胞凋亡和T细胞向抑制性调节细胞转化作用，有利于肿瘤免疫逃逸、生长和转移。有研究证明，靶向TIMs不仅可以逆转肿瘤免疫抑制微环境独立发挥肿瘤免疫治疗作用，也能增强其他免疫疗法的肿瘤治疗效果，但其免疫治疗强度和特点尚不清楚。中医药是免疫调节剂的重要药物来源，生姜作为药食同源的中药，具有温胃散寒、止呕、调理脾胃机能的作用。6-姜辣素是生姜中主要的生物活性成分，具有抗炎、抗氧化、抗血脂、抗肿瘤等药理作用。然而，6-姜辣素对巨噬细胞极化表型的影响以及这种影响是否与其抗肿瘤作用相关尚未见报道。本实验室前期研究表明6-姜辣素有防治肺癌的作用，本研究的目的是探索6-姜辣素防治肺癌的作用是否与调控巨噬细胞表型相关及其作用机制。
本研究分体外、体内和机制研究三部分。体外研究中，为了探索6-姜辣素对巨噬细胞表型的影响，分离小鼠腹腔巨噬细胞，分别用LPS和IL-4刺激腹腔巨噬细胞极化为M1型和M2型；用不同浓度6-姜辣素处理M1和M2巨噬细胞，MTT法检测对巨噬细胞增殖的影响；激光全息检测6-姜辣素对巨噬细胞形态、体积的影响；中性红和细菌吞噬实验分析巨噬细胞吞噬能力；免疫荧光检测其对巨噬细胞表型的影响。
体内研究中，建立乌拉坦诱导的小鼠肺癌模型，记录实验小鼠肺部结节数和直径；HE染色检测小鼠肺组织病理变化；免疫荧光检测6-姜辣素对肺组织巨噬细胞表型的影响，评价6-姜辣素对肺癌的预防作用。建立Lewis肺癌同种异体移植模型，记录荷瘤小鼠瘤重、瘤体积；检测过继性输注M1和M2巨噬细胞对肿瘤生长的作用；免疫组化检测肿瘤内巨噬细胞和淋巴细胞表型。采用氯屈膦酸钠脂质体(LEC)耗竭M2巨噬细胞，分析巨噬细胞在肺癌发生中的作用。
为了进一步探讨6-姜辣素调控巨噬细胞表型防治肺癌的机制，在体外，AO染色检测腹腔巨噬细胞中酸性自噬泡(AVOs)；免疫荧光检测自噬蛋白LC3-B、P62表达；DCFH-DA、Mito-TrackerGreen、Lyso-TrackerRed分别检测细胞内ROS、线粒体、溶酶体功能。在乌拉坦诱导的肺癌模型中，Westernblot检测肺组织自噬蛋白LC3-B、P62表达；免疫荧光检测清道夫受体MSR1、CD36和内质网应激GRP78。ELISA检测细胞因子精氨酸酶1、活性氧(ROS)、L-精氨酸、一氧化氮(NO)、集落刺激因子1(CSF-1)以及肺泡细胞因子干扰素-γ(IFN-γ)、白介素12(IL-12)、白介素10(IL-10)、转化生长因子-β1(TGF-β1)水平。免疫荧光检测LEC、精氨酸酶抑制剂(nor-NOHA)、集落刺激因子1受体抑制剂(Pexidartinib)对腹腔和肺组织巨噬细胞表型的影响。在Lewis肺癌同种异体移植模型中，免疫组化和Westernblot检测LEC、nor-NOHA、Pexidartinib肿瘤内巨噬细胞、淋巴细胞表型，评价6-姜辣素的M2巨噬细胞重编程作用。最后，运用网络药理学预测解释6-姜辣素调节巨噬细胞极化的分子机制。
体外结果显示，6-姜辣素在不影响细胞增殖的浓度范围内不改变M1极化表型，但以剂量依赖方式缩小M2巨噬细胞体积、降低其吞噬能力，促使其由arginase+M2巨噬细胞重编程为iNOS+M1巨噬细胞。
体内结果显示，在乌拉坦肺癌小鼠模型中，肺癌的发生与肺间质中巨噬细胞浸润呈正相关，这些浸润的巨噬细胞主要为arginase+M2表型。6-姜辣素增加iNOS+M1巨噬细胞比率，降低arginase+M2巨噬细胞比率，显著降低肺部肿瘤结节数和直径，改善肺组织病理结构异常。LEC选择性删除M2巨噬细胞对乌拉坦诱导的肺癌有明显防治作用，而Pexidartinib完全删除巨噬细胞却表现为促肺癌发生作用。在Lewis肺癌同种异体移植模型中，6-姜辣素阻止过继性输注M2巨噬细胞的促肿瘤作用，与过继性输注M1巨噬细胞协同阻止肿瘤增殖，同时增加肿瘤内CD8+细胞比率，减少Foxp3+细胞比率。
机制研究表明，6-姜辣素在体外促进M2巨噬细胞自噬，增强其线粒体和溶酶体功能，降低arginase1和ROS水平，升高L-arginine和NO水平，但不影响CSF-1水平。LEC或nor-NOHA选择性抑制M2巨噬细胞，增加6-姜辣素的促iNOS+M1巨噬细胞极化效应；而Pexidartinib同时抑制M1和M2巨噬细胞，也中止了6-姜辣素的促iNOS+M1巨噬细胞极化作用。在乌拉坦肺癌模型中，6-姜辣素诱导肺组织MSR1、CD36和GRP78表达；升高肺泡灌洗液中IFN-γ和IL-12水平，降低IL-10和TGF-β1水平，与LEC联合其防治肺癌作用增强，与Pexidartinib联合其防治肺癌作用减弱。在Lewis移植瘤模型中，6-姜辣素联合LEC增加肿瘤内iNOS+巨噬细胞比率和CD8+T细胞比率，减少Foxp3+T细胞比率，表现出协同抗肿瘤作用。网络药理学分析表明，6-姜辣素通过PI3K-Akt、Jak-STAT、TNF等通路调节巨噬细胞向M1型极化。
综上所述，M2巨噬细胞在肺癌发生中起重要作用，6-姜辣素能够通过将M2巨噬细胞重编程为M1巨噬细胞防治肺癌，与M2巨噬细胞耗竭剂或M1巨噬细胞过继免疫疗法联合使用有协同作用，其机制除主要抑制精氨酸酶外尚有多个通路参与。
本研究分体外、体内和机制研究三部分。体外研究中，为了探索6-姜辣素对巨噬细胞表型的影响，分离小鼠腹腔巨噬细胞，分别用LPS和IL-4刺激腹腔巨噬细胞极化为M1型和M2型；用不同浓度6-姜辣素处理M1和M2巨噬细胞，MTT法检测对巨噬细胞增殖的影响；激光全息检测6-姜辣素对巨噬细胞形态、体积的影响；中性红和细菌吞噬实验分析巨噬细胞吞噬能力；免疫荧光检测其对巨噬细胞表型的影响。
体内研究中，建立乌拉坦诱导的小鼠肺癌模型，记录实验小鼠肺部结节数和直径；HE染色检测小鼠肺组织病理变化；免疫荧光检测6-姜辣素对肺组织巨噬细胞表型的影响，评价6-姜辣素对肺癌的预防作用。建立Lewis肺癌同种异体移植模型，记录荷瘤小鼠瘤重、瘤体积；检测过继性输注M1和M2巨噬细胞对肿瘤生长的作用；免疫组化检测肿瘤内巨噬细胞和淋巴细胞表型。采用氯屈膦酸钠脂质体(LEC)耗竭M2巨噬细胞，分析巨噬细胞在肺癌发生中的作用。
为了进一步探讨6-姜辣素调控巨噬细胞表型防治肺癌的机制，在体外，AO染色检测腹腔巨噬细胞中酸性自噬泡(AVOs)；免疫荧光检测自噬蛋白LC3-B、P62表达；DCFH-DA、Mito-TrackerGreen、Lyso-TrackerRed分别检测细胞内ROS、线粒体、溶酶体功能。在乌拉坦诱导的肺癌模型中，Westernblot检测肺组织自噬蛋白LC3-B、P62表达；免疫荧光检测清道夫受体MSR1、CD36和内质网应激GRP78。ELISA检测细胞因子精氨酸酶1、活性氧(ROS)、L-精氨酸、一氧化氮(NO)、集落刺激因子1(CSF-1)以及肺泡细胞因子干扰素-γ(IFN-γ)、白介素12(IL-12)、白介素10(IL-10)、转化生长因子-β1(TGF-β1)水平。免疫荧光检测LEC、精氨酸酶抑制剂(nor-NOHA)、集落刺激因子1受体抑制剂(Pexidartinib)对腹腔和肺组织巨噬细胞表型的影响。在Lewis肺癌同种异体移植模型中，免疫组化和Westernblot检测LEC、nor-NOHA、Pexidartinib肿瘤内巨噬细胞、淋巴细胞表型，评价6-姜辣素的M2巨噬细胞重编程作用。最后，运用网络药理学预测解释6-姜辣素调节巨噬细胞极化的分子机制。
体外结果显示，6-姜辣素在不影响细胞增殖的浓度范围内不改变M1极化表型，但以剂量依赖方式缩小M2巨噬细胞体积、降低其吞噬能力，促使其由arginase+M2巨噬细胞重编程为iNOS+M1巨噬细胞。
体内结果显示，在乌拉坦肺癌小鼠模型中，肺癌的发生与肺间质中巨噬细胞浸润呈正相关，这些浸润的巨噬细胞主要为arginase+M2表型。6-姜辣素增加iNOS+M1巨噬细胞比率，降低arginase+M2巨噬细胞比率，显著降低肺部肿瘤结节数和直径，改善肺组织病理结构异常。LEC选择性删除M2巨噬细胞对乌拉坦诱导的肺癌有明显防治作用，而Pexidartinib完全删除巨噬细胞却表现为促肺癌发生作用。在Lewis肺癌同种异体移植模型中，6-姜辣素阻止过继性输注M2巨噬细胞的促肿瘤作用，与过继性输注M1巨噬细胞协同阻止肿瘤增殖，同时增加肿瘤内CD8+细胞比率，减少Foxp3+细胞比率。
机制研究表明，6-姜辣素在体外促进M2巨噬细胞自噬，增强其线粒体和溶酶体功能，降低arginase1和ROS水平，升高L-arginine和NO水平，但不影响CSF-1水平。LEC或nor-NOHA选择性抑制M2巨噬细胞，增加6-姜辣素的促iNOS+M1巨噬细胞极化效应；而Pexidartinib同时抑制M1和M2巨噬细胞，也中止了6-姜辣素的促iNOS+M1巨噬细胞极化作用。在乌拉坦肺癌模型中，6-姜辣素诱导肺组织MSR1、CD36和GRP78表达；升高肺泡灌洗液中IFN-γ和IL-12水平，降低IL-10和TGF-β1水平，与LEC联合其防治肺癌作用增强，与Pexidartinib联合其防治肺癌作用减弱。在Lewis移植瘤模型中，6-姜辣素联合LEC增加肿瘤内iNOS+巨噬细胞比率和CD8+T细胞比率，减少Foxp3+T细胞比率，表现出协同抗肿瘤作用。网络药理学分析表明，6-姜辣素通过PI3K-Akt、Jak-STAT、TNF等通路调节巨噬细胞向M1型极化。
综上所述，M2巨噬细胞在肺癌发生中起重要作用，6-姜辣素能够通过将M2巨噬细胞重编程为M1巨噬细胞防治肺癌，与M2巨噬细胞耗竭剂或M1巨噬细胞过继免疫疗法联合使用有协同作用，其机制除主要抑制精氨酸酶外尚有多个通路参与。