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普通脱硫弧菌(Desulfovibrio vulgaris)是一种异化硫酸盐还原菌,广泛存在于多种厌氧环境,如输油管,地下储油罐等石油生产设施,废水处理沉积物中。普通脱硫弧菌硫化还原过程中产生的酸性硫化物对含铁设施造成腐蚀,产生的H2S会危害工人的健康。在石油工业中,硝酸盐和亚硝酸盐可用于油井灌水,抑制普通脱硫弧菌造成的危害,但该菌株能够逐渐适硝酸盐压力而造成持续危害。了解普通脱硫弧菌对硝酸盐的适应机制能够降低该菌株对石油工业的危害。同时,普通脱硫弧菌中含有多个全局转录因子使其能适应各种外界压力,在含硝酸盐以及重金属污染等污染物,甚至放射性物质存在的环境中能够生存。分析普通脱硫弧菌的全局转录因子功能,能够帮助我们进一步了解普通脱硫弧菌抗压机制。为了了解普通脱硫弧菌对硝酸盐的适应机制,使用模式细菌希尔登伯勒普通脱硫弧菌Desulfovibrio vulgaris Hildenborough(DvH)作为研究对象。分别以DvH ATCC M208065的12株原始菌群AN1-12,以及6株在无压力(evolved under control condition,EC)和 6 株在氯化钠压力(evolved under salt stress,ES)下进化 5000 代的DvH菌群为初始菌群,在含有硝酸盐的乳糖/硫酸钠合成培养基(defined lactose/sulfate medium,LS4D)中传代培养至1000代,得到适应硝酸盐压力的EN(nitrate-evolved AN populations),ECN(nitrate-evolved EC populations)和 ESN(nitrate-evolved ES populations)菌群。通过表型和基因型分析研究普通脱硫弧菌对硝酸盐的适应机制。同时以DvHJW710作为出发菌株,对Crp/Fnr全局转录因子(DVU0379,DVU2097,DVU2547以及DVU3111)进行单一以及组合方式无痕敲除,通过对Crp/Fnr转录因子缺失菌群在不同压力下的表型的研究,并使用Agilent纯培养基因芯片技术分析野生菌和缺失菌的基因表达谱,进一步了解DvH的Crp/Fnr全局转录因子的功能以及其功能重叠,为研究究DvH对抗外界压力的机制提供线索。主要的结论如下:1.EN(evolved under nitrate stress,EN)DvH 群落和原始菌群(Ancestral populations,AN)相比,在30 m硝酸盐压力下硝酸盐适应性显著提高。EN的延迟期为(16.30±1.03)h,AN的为(27.33±1.15)h;EN 的比生长速率为(0.167±0.018)h-1,AN的为(0.118±0.014)h-1;EN的最大生物量(OD600)为1.176±0.048,AN为0.924±0.039。在50mM硝酸盐压力下,ECN菌群较相应的EC菌群而言,延迟期耗时减少(30.58±6.93)%,比生长速率提高了(22.95± 13.22)%,最大生物量提高了(14.31±2.52)%;ESN菌群较相应的ES延迟期耗时减少(36.59±7.25)%,比生长速率提高了(9.97±7.46)%,最大生物量提高了(12.33±3.72)%,在硝酸盐压力下进化的菌群的硝酸盐耐受性较出发菌群显著上升。此外,硝酸盐进化DvH菌群的细胞运动活性较出发菌群也有显著的提高。2.对出发菌群以及硝酸盐进化菌群的基因组DNA测序后进行比对,在硝酸盐适应菌群中,趋化蛋白基因cheB以及与其互作的基因(DVU3022,DVU1862以及DVU2394-DVU2396基因簇)发生了高频率的突变,与进化菌群的细胞运动增强这一结果相印证。同时,在所有硝酸盐进化菌群中,在硝酸盐适应基因簇(DVU0251-0245)和应对亚硝酸应激的Crp全局转录因子(DVU2547)HcpR以及其调控的基因上均发现突变,证明这两个基因簇在DvH的硝酸盐适应性上有着重要的作用。对发生突变的HcpR蛋白的二级结构和三级结构进行预测,发现HcpR蛋白的二级结构和三级结构的构型均发生了改变,表明HcpR蛋白可能参与硝酸盐适应性的调控。而且应对多种压力的常规应激如由Fur家族转录因子调控的铁稳态调节系统和LytS/LytR双组份系统的调控也在硝酸盐进化菌群中检测到突变。此外,参与脂肪酸代谢的酰基载体蛋白基因突变,推测细胞膜通透性相关的调控能够帮助DvH适应硝酸盐压力。综上所述,DvH的硝酸盐适应机制是由多方面的调控机制组成的。其中,趋化性相关的基因,硝酸盐适应基因簇,HcpR基因以及其调控的基因等对DvH的硝酸盐适应有很大的贡献。同时,常规压力应激也对DvH的硝酸盐适应性有一定的贡献。3.DvH 的四个 Crp/Fnr 全局转录因子 DVU0379、DVU2097、DVU2547 和 DVU3111能够调节细胞内代谢通路应对各种外界压力。为了研究上述转录因子的功能以及功能重复,采用读码框内敲除方法对上述四个基因进行单一以及组合的敲除,获得四个单敲除缺失株,六个双敲除缺失株,四个三敲除缺失株和一个四敲除缺失株。在研究野生型菌群和十五个缺失株分别在过氧化氢压力(H202),硝酸盐压力,亚硝酸盐压力,渗透压压力(NaCl)以及重铬酸钾压力下的表型后发现,这四个同系转录因子应对不同压力发挥特定的功能,同时他们也存在功能重复。其中DVU2547主要调控亚硝酸盐压力,DVU2097调控过氧化氢压力,而DVU3111调控氯化钠压力以及重金属铬的压力,与之前研究结论一致。同时本研究还发现,DVU2547对硝酸盐压力有显著的调控,DVU3111对亚硝酸盐压力有一定的调控,DVU0379对氯化钠压力有一定的正调控,DVU2097在重金属铬压力下发挥着一定的调控功效。而当这四个Crp/Fnr调控子均被敲除后,缺失菌依然能够对抗以上各种压力,证明在DvH中还存在其他调控方式来应对不同压力。4.本实验对新型Agilent纯培养基因芯片的实验条件进行测试,检测甲酰胺浓度对芯片探针结合特异性的影响,通过考察gDNA杂交率,cDNA的过饱和率以及假阳性杂交率,最终将芯片杂交使用的甲酰胺浓度确定为16.5%。之后采用上述基因芯片分别分析了野生菌JW710和Crp/Fnr转录因子缺失菌JWQ0123在氯化钠、硝酸钠和亚硝酸钠压力下的表达谱。主要结果如下:(1)在不同压力下DvH中的甲酸脱氢酶β亚基的表达量上升,说明DvH是通过甲酸作为中间代谢产物从而达到减少等效循环而增加代谢流效率,以应对外界压力;(2)在氯化钠和硝酸钠压力下,甘油转运与代谢相关基因表达的变化说明了硝酸盐对DvH产生渗透压力;(3)对比硝酸钠和亚硝酸钠压力应激表达谱,可以看出HcpR参与调控的基因均上调,说明HcpR在硝酸盐或亚硝酸盐压力下发挥着正调控的功效,与第四章结论相印证;(4)硝酸盐压力下细胞运动基因的上调,与第三章中硝酸盐进化菌株DvH细胞运动增强的结果一致;(5)JWQ0123中有关能量产生与转化,氨基酸转运与代谢,遗传信息转录与翻译以及细胞复制、修复的相关基因明显上调,辅酶转运与代谢的相关基因只在JWQ0123压力应激下检测到变化;(6)在硝酸钠和亚硝酸钠压力下,JWQ0123的细胞壁、细胞膜合成,蛋白翻译后加工以及信号传导相关基因有上调趋势;(7)JWQ0123压力应激条件下的色氨酸代谢相关基因表达量均上调,证明在Crp/Fnr转录因子缺失时,色氨酸代谢基因对外界压力有相应。上述结果表明,DvH的硝酸盐适应机制包含了多种压力调节机制,包括细胞运动性增强(化学趋化性相关基因的突变,细胞运动基因表达上调)的调节,硝酸盐基因簇相关基因(DVU0251-DVU0245)的调控,Crp/Fnr 转录因子hcpR(DVU2547)的调控,渗透压力适应机制(甘油代谢相关基因表达量改变)和常规压力调控机制(DVU0942和DVU2571的铁稳态调控,LytS/LytR双组份系统的调控,fabF对细胞膜通透性的调节等)以及能量代谢途径的调整。Crp/Fnr全局转录因子能够调节DvH应对不同外界压力,本实验中的四个Crp/Fnr转录因子既具有应对特定压力的功能,在应对外界压力时也有功能的重合。而当Crp/Fnr转录因子缺失时,色氨酸代谢相关基因能够调控DvH应对外界压力。