谷氨酸棒状杆菌ATCC 14067生产L-精氨酸的发酵优化

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作为一种重要的半必需氨基酸,L-精氨酸在食品、医药和饲料等领域应用非常广泛。谷氨酸棒状杆菌是生物发酵法制取L-精氨酸的主要菌种,然而野生ATCC 14067不积累L-精氨酸。在实验室前期的工作中,通过分子改造得到工程菌株ATCC 14067-XK99E-Peftu-argBH268E-argGH(BGH),其在CGXII培养基中摇瓶发酵72 h,L-精氨酸积累仅为0.6 g/L。本文利用遗传算法对CGXII培养基的组分进行了优化,使培养基的组分比例更适合谷氨酸棒状杆菌的生长及L-精氨酸的积累,得到优化之后的培养基gen3-14;虽然gen3-14培养基提高了谷氨酸棒状杆菌在发酵后期的生长稳定性及L-精氨酸积累量,但发酵前期的菌体生长略有下降。为了进一步改善菌体生长和提高L-精氨酸积累,在gen3-14培养基的基础上,探讨了添加不同浓度的大豆蛋白胨对菌体生长和L-精氨酸积累的影响,确定了在gen3-14培养基中加入2 g/L大豆蛋白胨的培养基配方BPgen3-14;发酵罐可以调控pH,温度和溶氧等工艺参数。在发酵罐水平,通过分析高中低三种溶氧水平下,谷氨酸棒状杆菌在不同发酵时间段的生长代谢和L-精氨酸积累,确定了分段溶氧调控策略。在分段溶氧条件下,L-精氨酸的积累量得到提升。1.以L-精氨酸的积累量为优化目标,利用遗传算法对CGXII培养基组分的配比进行优化,得到L-精氨酸积累最高的培养基gen3-14。谷氨酸棒状杆菌BGH在gen3-14培养基上摇瓶发酵72 h的L-精氨酸积累量为2.37 g/L,相较于未优化之前,提高了288.52%。通过分析优化过程中的菌体生长变化,发现遗传算法对CGXII培养基组分配比的优化改善了BGH在发酵后期的生长。在进一步的代谢分析中发现,遗传算法优化之后的培养基,增强了谷氨酸棒状杆菌BGH的TCA循环,并抑制丙酮酸转化为其他杂酸。2.遗传算法优化之后的培养基gen3-14未能改善谷氨酸棒状杆菌BGH在发酵前期的生长。为了进一步提高BGH的生长和L-精氨酸积累量,以gen3-14培养基为基础,探究了添加不同浓度的大豆蛋白胨对生长和L-精氨酸积累的影响。发现添加2 g/L和3 g/L的大豆蛋白胨可以显著提高谷氨酸棒状杆菌BGH的生长,且添加2%的大豆蛋白胨的条件下,L-精氨酸的积累值最高。因此得到在gen3-14培养基中添加2 g/L大豆蛋白胨的培养基BPgen3-14。谷氨酸棒状杆菌BGH在BPgen3-14培养基中摇瓶发酵72 h的L-精氨酸积累量为2.87 g/L,提高了28.13%。3.在发酵罐上可以进行pH,温度和溶氧的调控,且溶氧是L-精氨酸工业生产中非常重要的参数。在3L发酵罐上,通过分析5%,20%和35%三种溶氧条件下谷氨酸棒状杆菌在不同发酵阶段的生长代谢和L-精氨酸积累,发现在发酵前期0-18 h,35%溶氧条件下的乳酸积累较少,L-精氨酸合成速度较快;在发酵后期18-48 h,20%溶氧条件下的菌体生长更好更稳定,且20%溶氧下的丙氨酸积累较少,谷氨酸转化为L-精氨酸的效率更高。因此,提出分段溶氧调控策略,在0-18 h控制溶氧在35%,在18-48 h控制溶氧在20%。分段溶氧条件下的L-精氨酸积累达到7.02 g/L,对比20%和35%溶氧,分别提高了10.03%和29.20%。
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